【doc】荧光漂白恢复、荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点

【doc】荧光漂白恢复、荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点 荧光漂白恢复、荧光共振能量转移和荧光相 关光谱检测的技术特点 I学术论着中国医学装备2..9年6月第6卷第6期chiM.dj1Eqipm.t2..9J.v.1.6N..6 荧光漂白恢复,荧光共振能量 转移和荧光相关光谱检测的技术特点 于淼.高建. [文章编号】1672—8270(2009)06—0008—02[中图分类号]R197[文献标识码]B [摘要】荧光漂白恢复(FRAP),荧光共振能量转移(FRET)和荧光相关光谱(FCS)是 三种 以荧光为基础的检测技术,常用来研究分子间相互作用.对三种技术的特点做以比 较 和讨论. [关键词]荧光漂白恢复;荧光共振能量转移;荧光相关光谱;荧光检测 CharacteristicsofapplicationandtechnologyonFRAP,FRETandFCS/Yu Miao,GaoJian//ChinaMedicalEquipment,2009,6(6):8?9. [Abstract]Fluorescencerecoveryafterphotobleaching(FRAP),fluorescence resonanceenergytransfer(FRET)andfluorescencecorrelationspectroscopy(FCS) arethreeexperimentaltechniquesbasedonthefluorescenceanalysisthatare commonlyusedtostudymolecularinteraction.Inthisarticle.wewilldiscussand comparetheapplicationandtechnicalspecificationsforFRAPFRETandFCS. [Keywords]FRAP:FRET;FCS;FluorescenceAnalysis [First.author'Saddress]LaboratoryCenter,ChinaMedicalUniversity,Shenyang 110001,China. FRAP:经荧光素标记的某一区域被光照射后, 荧光物质的光化学结构被破坏,荧光强度下降,但随 之此处荧光强度会逐渐恢复,荧光强度与恢复强弱及 快慢代周围分子扩散的速率或分子运动速度J. FRET:受激态荧光素(供体)将其能量向另一 个荧光素(受体)传递,使后者被激发,这一过程称 荧光能量共振转移.测定FRET程度的参数,包括供 体淬灭,受体发射,供体荧光寿命,供体荧光去极化 笙[2] O FCS:是一种通过检测微区内(共焦体积)分子 ?中国医科大学实验技术中心辽宁沈阳?0001 8ZH0NGGU0;×.兰Zj舅基 作者简介 于森,女,(1980-),硕 士,助教.现就职于 中国医科大学实验技 术中心,主要从事激 光扫描共聚焦显微镜 工作 的荧光信息,(强度,波动,波 长等)来样品特性的检测 技术,类似于传统的荧光分光光度计,主要用于液态 样品的成份分析J. 以上三种技术的主要参数有: 扩散率:测量扩散的速率,通常表现在分子和分 子络合物的扩散系数. 多组分扩散:用来检测和区别单个和多组分之间 扩散的能力. 运动分量:检测能够自由扩散的组分. 中医学装备2009~6月第6卷第6期荧光漂白恢复,荧光共振能量转移和荧光十 【]Z-光谱检洲的技术特点一于淼等 浓度:提供一个不需独立校准测量分子浓度的能 力. 络合:检测分子络合. 络合化学计量学:检测分子络合的化学计量学, 如分子结合时的基本率等. 结合动力学:测量形成络合物的动力学. 比较三种技术的检测参数,见表1. 表1FP~AP,FP.ET及FCS检测参数 检测参数FRAPFRETFCS 扩散率oo 多组分扩散. 运动分量. 浓度. 络合oo 络合化学计量学. 络合动力学ooo FRAP是一种相对来说比较容易完成的技术.通 过扩散时间测量扩散系数,因而需要精心测量沿着Z 轴在xy平面上光束的半径.从FRAP中获得多个扩散 系数是非常难的.FRAP在三种技术中是唯一能够检 测运动分量的技术,但它不能独立作浓度检测.由于 其只能区分扩散系数,因此检测分子络合和测量这些 络合物的化学计量学的能力受限.FRAP在二维扩散 测定方面存在较特殊问题,如膜扩散,扩散系数依 赖于分子大小,而且成对数关系.FRAPn''~,够用来测 量分子动力学.但FRAP技术也有它的不足之处,第 一 ,它只能检测膜蛋白的群体移动,而不能观察单个 蛋白的移动,其次,它不能证明膜蛋白在移动时是否 受局部条件的限制. FRET一般不用作测量分子扩散,不能独立的 测量供体浓度,如果精确校准,可用来测量受体浓 度.FRET很难获得化学计量学的信息,经过精心校 准仅可获得有限的信息.FRET在测量络合程度变 化上体现出强大的技术能力,因此可用来测量络合 学术论着I 物形成的动力学.FRET又称为福斯特共振能量转 移,即在两个单独的荧光团之间的偶极诱导偶极的 作用.这种现象要求在独立的受体供体荧光对之间 的转换在相对分子距离小于10nm时才能发生,而且 供体的发射光谱与受体的吸收光谱要有实质性的重 叠.如果没有这种保证我们可能会被诱导,或者至 少不是纯粹定性. FCS是一种在很小容量内测定荧光强度相关变动 的单分子检测技术,可以用来测量单一组分和多种组 分的扩散.如同FRAP,测定扩散系数需要了解光束 的半径.FCS不能测量运动分量,未经校准时不能提 供一个直接和独立的浓度测量.由于这种浓度测量方 法能用来区分扩散系数,故FCS~''u提供络合物化学计 量学和结合等温线的测量数据.FCS也可以用来测量 络合物的形成率.FCS的测量依赖于有一个大的浓度 波动,这限制了其所能测量的浓度范围只能在FCS能 够测量的范围内. 综上所述,这三种新兴的实验手段为生命科学相 关研究开辟了新的研究途径和研究领域,需要根据这 三种荧光检测技术的不同,选择适合的实验方法,配 置适宜的软硬件功能r4】,完成相应的科学实验. 参考文献 [1】张志毅,周涛,巩伟丽.荧光漂白后恢复技术及其 在活细胞分子机制研究中的应用[J】.生物技术通 讯,2008(4):46-48. [2】张益珍,幸浩洋,李宜贵,等.荧光共振能量转移 技术及其在医药学中的应用[J].华西药学杂志, 2004,19(6):491-492. [3】袁兰.激光扫描共聚焦显微镜技术教程[M].北 京:北京大学医学出版社.2004:107-109. [4】崔泽实.荧光显微镜的功能配置及应用要点[J]. 医疗装备,2004,17(9):4-6. 收稿日期:2009-04-21 ZHONGGU0Yl×UEZHUANGBEI9