【doc】SHH对体外培养的小鼠牙乳头间充质细胞增殖的影响
SHH对体外培养的小鼠牙乳头间充质细胞
增殖的影响
?
中国新医药?ChinaNewMedicine?2004年第3卷第3期?
第一手资料,通过对大规模病例的研究及使用专科的颌
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救和医疗的战略部署,并对劳动保护,交通管理,治安管
理,保险赔付都有借鉴作用.
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注:本课题系军队”十五”指令性课题资助项目(01LJD75)
(作者单位:1第四军医大学口腔医学院710032
2西安电子科技大学710071)
SHH对体外培养的小鼠牙乳头问充质细胞增殖的影响
TheeffectofSHHongrowthofculturedmouse
dentalpapillaectomesenchymalcells
林媛吴补领陆群孙强韩骅
[文献标识码】A[文章编号】1726_9393(2004)03--0016-02
摘要目的观察SonicHedgehog对体外培养小鼠牙乳头阃克质细胞增
殖的影响.方法构建Shh真桉
达栽体pCDNA3-Shh,脂
质体法转染COS7细胞,收集培养上清波.实验组加入转染
pCDNA3-Shh的培养上清液,对照组加入转染空栽体pCDNA3的培养
上清液,
培养72}l,MTT法检测Shh对体外培养的小鼠牙乳头间充质细胞增
殖的影响.结果Shh能促进体外培养的小鼠牙孔头间充质细胞增殖.结
论Shh促进牙孔头细胞增殖,参与牙胚发育.
关键词Shh小鼠牙乳头间充质细胞细胞增殖
AbstractAIMToobservetheeffectofShhongrowthofculturedmousedentalpapillaectomesenchymala[)P日cellinvinD.
MethodsTwogroupsweredivide~themediumtransfectedbyplasmidpCDNA3-Shhasexperimentalgroups;themediumtransfected
byplasmidpCDNA3ascontro1.TheeffeCtofS}ll1ongrowthofculturedDPEcellswereexaminedbyMTT.ResultsTheresults
showedthatShhregulatesDPEcellsproliferationConclusionShhmayplayaroleintoothdevelopment.
KeywordsSonicHedgehogmousedentalpapillaectomesenchymalcellscellgrowth
Shh是Hedgehog(Hh)信号蛋白家族成员,在多器官
系统的正常发育过程中起关键作用,如底板,神经管的形
成,体节和肢体的极化等田.Shh信号途径在进化上高度
保守目,由Shh,2个跨膜受体Patched(Ptc)和Smoothed
Smo且成的受体复合物,蛋白激酶A以及下游转录因子
Gli家族(Glil,Gli2,G1B)等组成.信号传导时,Shh和Ptc
结合,Ptc-Smo复合物解离,Smo进入胞内,激活下游的
转录因子Gli家族.Shh信号的靶基因可能包括:Ptc,
Wnt,Bmp,Msx等.Shh可以调控上皮和间充质细胞的增
殖,作为上皮信号参与牙胚的发育.本文利用体外培养的
小鼠牙乳头问充质细胞观察Shh对其增殖的影响,以进
16
一
步探讨其在牙胚发育中的可能作用机制.
1材料和方法
1.1主要试剂和仪器:DMEM培养液(Gibco,美国),
胎牛血清(Hyclone,美国)’脂质体lipofectamine2000
(Gibco,美国),M11=1c华美生物工程公司),胰蛋白酶(华美生
物工程公司),限制性内切酶(TaKaRa),质粒小量提取
试剂盒,凝胶回收试剂盒(上海华舜公司).
1.2方弦
1.21构建Shh真核表达载体:克隆载体pMD18一
T_Sh取酶切后琼脂糖凝胶电泳,胶回收获得Shh全长,
与表达载体pCDNA3连接16~C2h,转化大肠杆菌XI,-l0
中国新医药?ChinaNewMedicine?2004年第3卷第3期?
Go1随机挑取4个克隆,37?振荡培养,质粒小量提取
试剂盒提取质粒,用Bgln和BamH1分别进行酶切鉴
定,重组质粒命名为pCDNA3_slll1.
l22实验分组:重组质粒pCDNA3--Shh,空载体
pCDNA3分别以脂质体法转染COS’/细胞,48ll收集培
养上清液,经SDs-PAGE和Westernblot检测S}Ill在
C0S7中表达.实验组加入转染pCDNA3-Shh的培养上
清液.对照组加人转染空载体pCDNA3的培养上清液.
1.2.3MTT法检测细胞增殖:取第4代小鼠牙乳头
细胞,以|xlOS/ml接种96孔板.每孔100,每组1O孔.
lOOml/L胎牛血清的DMEM培养24}l后,换20ml/L胎
牛血清的DMEM培养24h,吸弃培养液分别加入实验组
和对照组的培养液,培养7PA,每孔加5mg/mlMTr
20,继续培养4h,弃去培养液,每孔加15qDMSO振
荡10min,酶联仪波长490nra测各孔A值,统计学处理.
2结果
2l重组质粒的鉴定:重组质粒pCDNA3-Shh用
BgllI和BamH1分别进行酶切鉴定,分析酶切图谱,克
隆2,3为正确克隆,与预期的完全一致(图1).
l2345678910
(1-4:Bg11I酶切;5,6:DNAMarker.7-10:BamHI酶切)
图1pcDNAB-Shh重组质牡酶切鉴定
2.2M1rr检测:
如表1所示,实验组细胞增殖活性高于对照组(P<
0.05).即Shh可以促进小鼠牙乳头细胞的增殖.
3讨论
Hedgehog是一类在胚胎发育过程中起关键作用的
信号分子.它有3种不同的类型:Sonic~3hh),Indian(1hh)和
De日eh.1995年Tahin~ig克隆了人Shh编码区,其
编码氨基酸与鼠Shh氨基酸高度同源ez4%),Shh表达
于胎肝,肺,肾和小肠,而在成体组织未检测到其表达.陈
智等观察了Slll】及其受体Ptc在鼠帽状期磨牙的基因
表达.Shh在口腔上皮,内,外釉上皮,星网层阳性表达;
受体Ptel在内,外釉上皮,星网层以及牙乳头阳性表达,
认为Shh可能经自分泌或旁分泌途径作用于釉结以外
的上皮和间充质促进其增殖.本实验将重组表达的Shh
作用于体外培养的小鼠牙乳头间充质细胞.结果表明
Shh促进牙乳头细胞的增殖,提示Shh通过受体Ptcl途
径,促进细胞增殖,参与牙胚发育.
作为形态生成素,Shh参与耳,毛发,肺等多脏器组
织的发育.随着对Shh的深人研究,对其功能的认识不
在局限于胚胎发育.Enomotd~发现表达Shh的皮肤
成纤维细胞可以异位成骨(软骨),同时BMP2可以增强
Shh的促分化作用,而FGF2则抑制其作用.蹲研究
发现shb可以调节成年神经前体细胞的增殖;Artem匠
实Shh诱导神经上皮细胞分化,减少细胞粘附,并且这
一
双重作用包含不同的细胞机制.Sh}耀进造血前体细
胞的增殖.NogginMP4-抑制
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(作者单位:1第四军医大学口腔医学院710032
2第四军医大学医学遗传学教研室)