甘油葡萄糖共发酵一个以利用丙酸杆菌生产丙酸的成熟的工艺

甘油葡萄糖共发酵一个以利用丙酸杆菌生产丙酸的成熟的工艺 甘油/葡萄糖共发酵:一个以利用丙酸杆菌生产丙酸的成熟的工艺 摘要 共发酵是一个提高主体代谢产物的有效的策略,以甘油和葡萄糖作为碳源可以用来研究丙酸的生产。带着提高丙酸生产量的目的，我们对丙酸杆菌利用甘油、葡萄糖以及它们混合物对丙酸生产的作用进行了研究。培养基中丙酸的产量从0.475μg甘油和0.303μg葡萄糖独自发酵提高到了0.572μg利用甘油/葡萄糖4/1 (mol/mol)共发酵。最大的丙酸和底物转化率分别为21.9克L-1和57.2%(w/w)。明显高于以甘油或葡萄糖为唯一碳源。在分批补料发酵试验中，最大的丙酸产量和底物转化效率分别为29.2 g L-1和54.4%(w/w)。这些结果明，甘油/葡萄糖共发酵可以更好的替代传统的丙酸发酵。 引言 丙酸，一种重要的防霉剂和化学中间体，被广泛的应用于工业生产尤其是食品工业中。2006年，丙酸的全球年生产能力为349000吨。预测2010年前年需求增长为2.5%。目前几乎所有的丙酸均是由石油化工流程生产的。但丙酸的生物合成因其可再生的生物原料来源和消费需求的日益增长有望成为一个有前途的选择。虽然目前已经对由丙酸杆菌发酵生产乳酸产生了浓厚的兴趣。但生产丙酸的浓度、产量和生产效率相对较低，这是阻碍其进行经济利用的最主要的障碍。 碳源，是在丙酸生产过程中最重要的营养元素。丙酸杆菌可以利用不同的碳源来进行菌株生长和形成有机酸。但特定的碳源对细胞的生长以及底物的消耗量和副产物的形成有极大的影响。碳源通过细胞反应影响丙酸杆菌的丙酸发酵动力学，重新分配发酵最终产物来实现氧化还原平衡。丙酸发酵过程中不同碳源的代谢模式已经通过使用代谢化学计量分析证明，同时也被证明存在不同的控制机制。为了达到最大的丙酸产率并减少代谢产物的生成，需要对丙酸生产过程中的碳源利用做进一步优化。 传统丙酸发酵通常采用单一碳源，混合碳源也已被提出作为有用的替代品。通常，唯一的碳源不能满足丙酸杆菌生长和丙酸的生产要求。混合碳源可以通过改变丙酸发酵的动力和最终产品的成分来提高丙酸生产量。尽管用于丙酸生产的大量各种碳源已经被研究出来，但混合碳源仍然很少被考虑。 目前的研究旨在提出甘油/葡萄糖共发酵理论，也为了开发一个丙酸生产的新型的生产工艺。调查的主要目的是评估在P丙酸的批量和分批发酵中使用甘油/葡萄糖混合物的优势。因此，甘油/葡萄糖的混合物是被提出来提高丙酸生产量，并且达到更高效的生产工艺的。材料与方法 菌和培养基 从CGMCC(中国北京)收集的丙酸菌和丙酸CGMCC1.2225(ATCC4965),可以在含有葡萄糖，甘油或者混合底物的基本培养基生长。种子培养基是TY培养基(pH 7.0)[ 7 ]，包括0.5%胰蛋白胨大豆发酵液，1%的酵母粉， 0.25%的磷酸氢二钾，和0.15%的磷酸二氢钾。生产丙酸的培养基是在TY培养基中添加4%甘油(TYG培养基)，葡萄糖(TYD培养基)，或甘油/葡萄糖的混合物(TY培养基)。 培养 将丙酸杆菌预培养于含有100毫升氮毒气和无菌的TY培养基的250毫升青霉素瓶中，采用丁基橡胶帽密封，接种在往复式摇床(150r/m)上48小时，温度30?C。除非另有说明，发酵是在一个生物玻璃生物反应器中进行的，(BIOSTAT B加，B.布劳恩，德国)该生物反应器包括由最初的含氮喷射介质在厌氧条件先产生的2 L产物培养基。使用5%(体积/体积)的接种物。温度，PH值，搅拌速度分别保持在30?C，6.5，和150转。所有发酵都进行重复。 测定 细胞干重(DCW)从OD值计算。一个单位OD相当于0.325 L??DCW。葡萄糖是使用sba-40 C固定化酶生物传感器测定的(生物研究所，山东省科学院，中国)，而甘油是利用比色法测定的。丙醇，乙酸和丙酸，利用气相色谱定量(瓦里安450-GC，美国)，用毛细管柱(FFAP;FFAP; 25 m x 0.25 mm x 0.20 µm;美国)，火焰离子化检测器(FID)，并且注射和检测端口温度设置在240?C。毛细管柱的温度最初是在80?C，维持 1分钟，后来增加到25?C /分钟，维持1.6分钟;30?C /分钟，维持0.5分钟;25?C /分钟，维持3分钟，并固定180?C维持1分钟。琥珀酸的测定如前述。 结果和讨论 甘油和葡萄糖发酵的比较 使用不同氧化态的碳源影响丙酸发酵的动力。甘油和葡萄糖发酵的比较可以更好的理解细胞如何响应这些底物和分配碳通量。在P.詹氏40 g L?? 甘油或葡萄糖进行分批培养，选定的参数见表1。发酵液中丙酸的最大浓度为18.1克L?? 是出现在以甘油为唯一碳源的时候，而使用葡萄糖作单一碳源的时候浓度只有11.5 g L??(图1)。葡萄糖作为碳源时，生产速度和丙酸产量分别为0.068 g l??h??和0.303gg??，而使用甘油时，这两个值均较高(分别为0.108 g l??h??和 0.475 gg??)。看来，丙酸发酵时，甘油优于葡萄糖，但是，当考虑DCW，葡萄糖是优选的碳源，葡萄糖可以得到6.8 g L??DCW，这是较高于从甘油获得的3.3 g L??DCW的。(表1;图1)。因此，由这种细菌研究甘油/葡萄糖混合物对细胞生长和丙酸生产的影响是合乎逻辑的。根据先前的研究[ 5，9，11，12，18 ]和方程式1a和1b描述的甘油和葡萄糖对丙酸的单一代谢过程，得出图2定性描述的共代谢过程， 系数的值α和β是变化的以保持氧化还原平衡。 表1 不同培养条件下的参数分析 数据为三组实验数据的平均值 ND 无检测值 图1 对比葡萄糖(a)和甘油(b)分批发酵的产量、底物利用率和产物组成对比。生物量 (实心三角形)、葡萄糖/甘油(实心圆形)、丙酸(实心正方形)、乙酸(空心三角形)、异丙醇(空心圆)。通过添加NaOH来控制ph为6.5。数据误差的范围约为2 生物量的形成伴随着NADH的产生或消耗来保持氧化还原反应的平衡。如表2所示，甘油的消耗量高于葡萄糖和生物量。因此，从甘油消耗产生的生物量导致NADH的产生，与之相对应的是葡萄糖会导致NADH的减少(图2)。在细菌的分解代谢中，消耗的NAD+ 的再生需要碳源发生氧化反应。该丙酸杆菌是一种厌氧型细菌，所以NAD+的形成只能通过减少最终产物的形成来实现，比如减少琥珀酸、异丙醇的形成。因此，在代谢网络中NADH的形成会影响最终产物的生成。 用甘油/葡萄糖混合物进行间歇发酵的研究 用250ml青霉素瓶在厌氧条件下一组用甘油/葡萄糖初始摩尔比为4/1、2/1、1/1分批培养。结果表明:初始甘油/葡萄糖摩尔比在共发酵过程中起了重要作用(图3)，最佳摩尔比为4/1。 细胞生长率(LX)和特定丙酸生成率(LP)用来描述丙酸的发酵过程。LX和LP的趋势相似，最大值均出现在约12h(图4)。相比于使用葡萄糖或甘油单独发酵，共发酵中LX和LP的值均较高;这些结果表明，混合碳源能够更加有利的促进细胞的生长和丙酸的生产(图4A)。 图2 在厌氧条件下甘油和葡萄糖共代谢途径下产生丙酸的研究简介 甘油/葡萄糖生产丙酸的共发酵策略 为了评价丙酸发酵的产量和生产率参数，利用发酵批量模型进行了甘油/葡萄糖(4/1)混合发酵试验。图5显示，葡萄糖和甘油几乎同时被消耗。用甘油单独发酵获得的丙酸产量和最大DCW值为18.1和3.3 g L-1。而使用葡萄糖单独发酵获得的丙酸产量和最大DCW值为11.5g/L和6.8g/L。单独利用甘油或葡萄糖都不是丙酸生产和细胞生长的最佳碳源。因此，葡萄糖和甘油共发酵生产是提高丙酸产量的最佳手段。与利用葡萄糖或甘油单独发酵相比，甘油/葡萄糖(4/1)共发酵产生较高的丙酸(21.9g/L)。与甘油单独发酵相比，共发酵能够提高20%的丙酸产量(0.572 vs. 0.475 g g-1);与葡萄糖单独发酵相比，能提高89%的丙酸产量。共发酵过程中增加丙酸产量的原因可归纳为发酵过程中副产品生产的减少和丙酸生产中较高的碳利用率。 Himmi等人2007年曾报道，相较于利用葡萄糖，利用甘油使用丙酸杆菌进行异丙醇的生产产量更高。但是就目前研究表明，只有在利用甘油发酵过程中才会产生异丙醇。此外，在甘油/葡萄糖共发酵过程中，也未检测出异丙醇，也可以避免毒性丙醇的出现。 利用丙酸杆菌生产丙酸过程中，利用甘油作为底物比利用葡萄糖作为底物产生的乙酸的量低80%(图1)。众所周知，甘油、丙酸具有基本相同的氧化还原状态，因此不需要另一种补偿代谢物产生就可以保持氧化还原的平衡。相比之下，利用葡萄糖进行发酵生产丙酸，必将产生更多的氧化代谢产物(如乙酸)来实现氧化还原反应的平衡。因此，利用葡萄糖进行发酵会产生乙酸从而降低丙酸的产量。在甘油/葡萄糖共发酵过程中，葡萄糖通常被用作氢供体底物提供还原剂，并提升丙酸杆菌的生物量，而甘油主要用于丙酸的生产。使用这两种底物进行共发酵生产，可以获得较低浓度的乙酸(0.87g/L)和一个高的丙酸/乙酸摩尔比(20.4)。因此联合发酵能够显著的提升丙酸的产量。 图3 不同时间下利用丙酸杆菌丙酸产量和生物量 甘油(实心正方形)、葡萄糖(空心正方形)、甘油/葡萄糖(4/1)(空心圆)、2/1(实心三角形)、1/1(实心三角形)。通过NaOH调节PH为6.5，误差范围(n?2) 图4 利用甘油或甘油/葡萄糖共发酵特定生长率(LX)和特定丙酸生产率(LP)比较(a); 利用葡萄糖或甘油/葡萄糖共发酵特定生长率(LX)和特定丙酸生产率(LP)比较(a); 图5 不同时间丙酸杆菌利用甘油/葡萄糖共发酵生产丙酸 生物量(实心三角形)、葡萄糖(空心圆)、甘油(实心圆)、丙酸(实心正方形)、琥珀酸(空心三角形)、乙酸(空心三角形)。通过NaOH调节PH为6.5，误差范围(n?2) 图6不同时间丙酸杆菌利用甘油/葡萄糖补料分批发酵(4/1)生产丙酸 生物量(实心三角形)、葡萄糖(空心圆)、甘油(实心圆)、丙酸(实心正方形)、琥珀酸(空心三角形)、乙酸(空心三角形)。通过NaOH调节PH为6.5，误差范围(n?2) 当量分析(MSA)表明，NADH和丙酮酸扮演了一个控制或限制丙酸生产的关键角色。丙酮酸被发现是一个常见的从甘油或葡萄糖生产丙酸产生的中间代谢产物(图2)。丙酮酸供应不足，会导致代谢转向乙酸的形成。相似的，足够且大量的供应丙酮酸会让其代谢产物产生向丙酸倾斜。此外，当丙酮酸供给过量而作为电子受体时，丙酮酸会被氧化为乙酸。甘油和葡萄糖共发酵对于生物量形成导致了对NADH和ATP的更低的需求量。因此，目前的实验结果和化学计量分析结果表明共发酵导致了代谢向丙酸的形成。与甘油或葡萄糖单独发酵相比，丙酸的产量得到了显著的增加。 此外，这种共发酵生产丙酸的方法还可以将发酵时间从168h缩短到144h，并且丙酸产 生量优势明显(表1)。 利用丙酸/葡萄糖补料分批发酵生产丙酸策略 通过分批培养添加甘油/葡萄糖混合物为(1/4)，保持一个较为平衡的底物浓度(10g/L)(图6)。最终发酵192h后，丙酸的产量和底物转化率分别为为29.2g/L和54.4%。 结论 一种利用丙酸杆菌有效提高丙酸生产的共发酵策略。甘油/葡萄糖的最佳摩尔比为4/1，与利用单一碳源(甘油)相比，分别提升了丙酸的产量和生产率为20%和21%。分批发酵结果表明最大丙酸产率和底物转化率为29.2g/L和54.4%。通过利用甘油/葡萄糖分批补料发酵提高丙酸产量和减少副产物的形成的方法生产丙酸更具有潜力，方便简洁，下游设备处理廉价。这项研究提供了一个替代传统丙酸发酵的良好选择。然而，必须强调的是，进一步的必要研究正在进行中，如NADH的供应及其调控对发酵的影响等。