【doc】实验小鼠受精卵染色体制备法

【doc】实验小鼠受精卵染色体制备法 实验小鼠受精卵染色体制备法 苏州医学院 ACADEMIAEMEDICINAESUZHOU1990;1oO):312 实验小鼠受精卵染色体制备法 徐呜高锦声郑斯英 (苏州医学院医学与辐射遗传学研究室) 摘要介绍小鼠受精卯染色体带恪过程.实验以Tarkowski法为基础并加以改进,取 得了 稳定而满意的结果.实验中还根据国内一般实验室的条件.探讨了各种影响因素. 关髓词受精卵;染色体小鼠 一 般用体细胞染色体检羽j射线,化学诱 变剂,病毒等外源因子的遗传效应.但有研 究证明体细胞对外原因子的敏感性与生殖细 胞并不相同].受精卵染色体制备技术巳有 一 些报道】.我室参考Torkowski及包 淳洋的方法并稍加改进,获得较为稳定的满 意效果(见图1,2).现将制备方法舟绍于 下. 制备晨理与方法 哺乳动物精子穿入卵细胞后,在卵细胞 内各种酶的作用下,精子头部膨胀,异固缩的 染色质形成染色体,为胚胎发育分化作好准 备.受精卵第1次卵裂时制作的染色体,根据 其形态及染色深浅,分析和判断是雄性还是 雌性的染色体.本实验主要试剂为孕马血清 (PMSG)和人绒毛膜促性腺素(HcG),PMSG 使卵泡超数成熟,HCG使成熟的卵泡排卵, 两者台并作用为超数排卵. 过程:(1)实验用小鼠品系为IcR,雄性, 9—2O周龄;雌性0—13周龄.(2)促超数排 卵,每只雌鼠由腹腔注射PMsc5Iu,48h 后,腹腔注射HCGSIU.(3)注射HCG后立 即放入雄鼠笼中待交配.雌雄为2:1或1:1 (一般小鼠在注射HCG后13h即排卵)次日 上午检查阴栓,阴栓阳性者为交配成功.(4) 取出交配的雌鼠.于注射HCG29h后腹腔注 射秋水仙素(Co1)4mg/kg体重.(5)注射 col后3h制备染色体. 处死雌鼠,剪下输卵管及部分子宫,(在 解剖显微镜下)用注射器从输卵管伞部腹腔 口处将受精卵冲出.去除异常及两细胞卵. 若卵细胞周围带有颗粒细胞,可用7501U/ml 的透明质酸酶消化5rain左,右,直至颗 粒细胞完全从卵细胞上脱落.然后用Hank 液冲洗2次.用1呖柠檬酸钠低渗15rain. 用细毛细管吸取10个左右卵细胞放在 载玻片中央,用新鲜配制的固定液(甲 醇:冰醋酸=3:1)20v.1.滴在卵细胞上固定, 千后再固定2次,空气中干燥,10%Giemsa (pH6.8)染色10rain. 靠一染色体镧备的因素厦讨论 一 ,动物超数排卵的成败是实验的首要 因素.在自然状况下,小鼠一般排出10个左 右的卵细胞,但注射PMSc和HCG后,可 诱发小鼠超排卵达30多个(最多达60多 个).PMsc的质量是诱超排的关键,进口 PMSa的效价较高,一般进口PMS每只小 鼠用5IU,而国产需用8~IOIU.配制好的 PMSG应保存在0?以下,且不宜放置过 久. 二冲卵及制片操作中,如不能垮卵全 部冲出,将造成不必要的丢失. 三.滴片时,载玻片要十分干净.滴在 玻片上的含受精卵细胞的低渗液直径不应超 过2mm.茌加入固定液的最初几秒钟内,能 看到卵在玻片土的位置,此时应及时用笔圈 第4划待呜等,验小鼠受精印染色体制备} 出.以便以后镜检 凹,一般在室温2o一25?最为适宜. 室温过高时,应适当缩短低渗时间,反之,要 延长时间,若无空讽设备,刚以春秋两季宴验 较合适. 五镜检时,雌雄染色体的区别为:雄性 染色体较细长,染色较浅.雌性染色体较粗 短,染色较深.有时,雌雄染色体染色深度相 差不大,则主要依据形态进行鉴别. 附;卵细胞染色体制备法 成熟雌鼠腹腔注射PMse5Iu48h后, 腹腔注射HCG51U.此时不必与雄鼠交 配.注射HCG2oh后,处死小鼠,取出输卵 管.在解剖显微镜下,用针尖从输卵管壶腹部 较细的一端刺破输卵管,即可见带有颗粒细 胞的卵细胞从输卵管刺破处喷出,随后用透 明质酸酶消化.以后操作步骤与受精卵染色 体制备相同. (本文图1,2见封旧) 参考文献 [1]黄天华.人精于染色体研究遗传与安病 I985;4(2):251 r2_TarkowskiAK.Anair-dryin~methodfor chromosomepreparationfrommouseeggs. Cytogenetlcs1966:5:394 [3]KatohM,eta】.PelaHonshiPbeteen chromosom?aberrationinthefirst clearagemetaphasesandunscheoluled DNAsynthesisfollowingpaternalMMS treatment.JpnJGenetl980:56:56 『4]包淳洋.等小鼠受精卵染色体制备法遗传 i986?3:4 (1989年11月9日收稿) f (上接第811页) 较好的参数,说明本法比较正确可靠.其重 现性的CV值为6.42,偏高的原因可能为 Cs一93o扫描仪相当敏感.为此我们又将 Cs一93o扫描的相应1o—HDA色点,剪下, 经洗脱剂洗脱,分光光度法比色,计算出的重 现性CV值为1.48衙.说明CV偏高不是方 法而是仪器原因. 本法比较灵敏.一般认为气相色谱法灵 敏度为7.5Xi0,mol/L,高压液相色谱法, 灵敏度为2.1X1O-'rmol/L,本法灵敏度可达 5.3Xl0-smol/L.因此,可检澜I蜂皇浆制 品中微量10--HDA 本技术的特点:样品提取时,把蜂皇浆及 其制品中的水溶性羧酸与硝溶性羧酸分开, 达到充分提取脂溶性羧酸,包括10一HD选 用石油醚:乙醚:冰醋酸=3.0:2.0:0.5(V: V:V)展层剂和新颖的聚酰胺薄膜,使各种 脂溶性羧酸完全分开,得到完全纯化的 lO—HDA,通过显色,最后定量.本法尚未 见国内外报道. 参故文赫 rl_TakenakeTohlfum,eta1.Thecorrelatlo口 betweenthelateralmotionofmembrane llpidsandnervemembraneexcitabllity. BiomedRes1986:7:49 [2]史满田.等蜂王浆中l0一羟一?一癸烯酸的 测定中国养蜂1987;5:26 [3]孙英梅.等速电泳分离分析技术药物分析杂 志1983j3(5):311 [4]周显着等应用匣相高教液相色谱外标浩测 定蜂皇浆奠其制品中1o--HDA含量中国养 蝰1987:6:3 (1989年9月4日收稿)