小鼠脾细胞原代培养,死活细胞鉴定小鼠脾细胞原代培养,死活细胞鉴定
山东大学实验报告
山东大学实验报告 2013年6月8日
姓名 陈少坤 系年级 2011级生科2班 同组者 张劲松 王洪善 科目 细胞实验 题目 小鼠脾细胞原代培养,死活细胞鉴定
一、 前言
细胞培养的概念:多细胞生物的细胞可以被分离出来,然后在体外特殊
培养环境中继续存活,并保持其生理、生化特性
直接从生物体分离出来,在体外培养过程中尚未分裂、增殖的细胞,
称为原代培养细胞。原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖,在数量
上大量扩增,这时就成为继代培养细胞。
细胞培养基要满足细胞...
小鼠脾细胞原代培养,死活细胞鉴定
山东大学实验
山东大学实验报告 2013年6月8日
姓名 陈少坤 系年级 2011级生科2班 同组者 张劲松 王洪善 科目 细胞实验 题目 小鼠脾细胞原代培养,死活细胞鉴定
一、 前言
细胞培养的概念:多细胞生物的细胞可以被分离出来,然后在体外特殊
培养环境中继续存活,并保持其生理、生化特性
直接从生物体分离出来,在体外培养过程中尚未分裂、增殖的细胞,
称为原代培养细胞。原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖,在数量
上大量扩增,这时就成为继代培养细胞。
细胞培养基要满足细胞的生长需要,包括 pH、渗透压、营养和生长
因子等,已保证细胞的增殖。细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。
细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。它可以提供合适的温度和二氧化
碳浓度。二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用,保持细胞培养液的
酸碱度。
超净台通过将空气进行过滤,为细胞培养的各种操作提供了一个干
净的环境,使细胞培养免于细菌和真菌的污染。
细胞培养特点:
大量实验材料
单一、纯粹细胞类型
培养基的成分可控,即生长条件可控/全合成、无血清培养基
易于观察
易于操作,改造
活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定
性。细胞死后,细胞膜通透性发生改变,原先不能进入细胞的物质也能
够进入细胞。台盘蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外,只有细
胞膜受损或者细胞死亡后,才能进入细胞。因此,活细胞一般不能被台
盘蓝染色,而死细胞会被染成蓝色。
伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂。
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二、 实验目的
回顾细胞培养的有关
学习分离小鼠脾细胞的技术
学习悬浮细胞的计数
学习简单的细胞培养技术
学习实验过程的详细描述及实验记录
三、 实验用品
试剂:
小鼠,70%酒精,蒸馏水, PBS, 细胞培养液,台盘蓝,伊红溶液
仪器
解剖盘,镊子,剪子,盖玻片,载玻片,显微镜,吸管,血细胞计数器
四、 实验步骤
一、原代培养
1.采用颈椎脱臼的方法牺牲小鼠。
2.将小鼠浸泡在 70%酒精中几分钟。
3.将小鼠平放在解剖盘内,腹部向上。用镊子夹起下腹部毛皮,用剪子剪
一个横向小口,然后用手用两边撕开,暴露肌肉层。或者用剪子向斜上
方剪一个V字开口。将肌肉层向斜上方剪一个V字开口,向上翻开,暴
露腹腔。
4.在腹腔左上方,将胃拨开,暴露出后方的暗红色、扁平、长条状的脾。
将脾剪下,放入玻璃平皿中。
5.注射器中加入0.2ml PBS。将L-型针头沿脾的纵轴插入脾中,注射PBS
后,脾将涨大,颜色变浅。
*注意,不要扎穿脾
6.用针头在脾上扎一些孔,然后有针头的沿水平方向挤压,刮擦脾,使脾
细胞从小孔中释放到 PBS 溶液中。最后脾由暗红色变成黄白色,而 PBS
溶液变红。将脾的残骸丢掉。
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7.将混有细胞的 PBS 用吸管吹打数次,使细胞团分散为单个细胞。 8.将细胞悬液转至微离心管中,加PBS至1ml,500g离心5分钟。 9.弃去上清,将细胞沉淀1ml 细胞培养液悬浮后,用移液枪取200ul的
细胞培养悬浮液加至事先加有1ml 培养液的细胞培养皿中。 10.单向摇晃培养皿,使细胞均匀分散开。
11.在细胞培养箱中培养一到两个星期。
、死活细胞记数 二
1.先用肉眼,然后用显微镜观察培养的细胞。
2.敲打培养皿,使贴壁细胞释放出来。旋摇 培养皿,使细胞充分悬浮。 3.取 0.5ml 细胞悬液,分别加入一滴台盘蓝,或 1.5ml 伊红。轻轻混
合后,室温下染色二分钟。
4.在计数器上盖上盖玻片。
5.将细胞悬液滴在计数器两边 V 字形槽内。细胞悬液依毛细作用扩散到
计数区。
6.在镜下计数。取中间和四个角上的中等方格,计数每个方格内死活细胞
的数量。
4 细胞浓度(个/ml) =5 个中等方格内的细胞总数×5×10× 稀释倍数。 注意:当遇到位于大格线上的细胞,一般只计数大方格的上方和右方线
上的细胞
五、 实验记录
培养之前
培养一周之后
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死活细胞鉴定
死细胞 活细胞 左上中格 20 9 左下中格 41 11 中间中格 23 6 右上中格 33 11 右下中格 40 10
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记:由于培养的细胞大多死亡,故在做第二步死活细胞鉴定时,是将培养细胞和培养好的活细胞按照大约体积2:1的比例混合后进行观察的。
六、 实验结果
计算
4 6细胞浓度=194×5×10=9.6×10个,ml
七、 总结
1、取小鼠脾时注意保持其完整,注入缓冲液要慢而准且适量,不要撑破脾
脏,保证细胞分散游离出来。
2、培养液PH为7.0~7.4,其中加有酚酞,正常状况细胞生长过程代谢物使
PH下降,培养液的颜色改变呈黄色,因此可通过培养液颜色变化初步判
断细胞生长状况。
3、生长状况良好的细胞膜和核完整,细胞质透明,而细胞质出现较多颗粒
状或空泡证明细胞衰老。除游离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。游离
期细胞一般圆形,折光率高,而衰退期细胞皱缩,透明度下降,立体感
很差,较易区分。
4、倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放,可以允许连同培养皿一同观
察。
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