对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备_表征及抗菌活性

对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备_表征及抗菌活性 王河东 等: 对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备、表征及抗菌活性 839 对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备、表征及抗菌活性 王河东 王江涛 中国海洋大学 海洋化学理论和工程技术教育部重点实验室 山东 青岛 266100摘 要: 壳聚糖 CT S 经氨基保护合成席夫碱 再与 2 实 验由对氨基苯甲酸和氯化亚砜制备的对氨基苯甲酰氯反应 产物在一定 pH 下氨基去保护得到了对氨基苯甲 2. 1 主要药品与试剂 1酸壳 聚糖 酯 ABCT SE 。 产物 经 F T- IR、H NMR、 试剂: 壳 聚糖 CT S 脱乙酰度 97 相对分子质13 C NM R 进行结构表征 证实为 目标产物 由元素分 量 1 105 青岛海汇生物工程有限公司 对氨基苯甲析得到所制得壳聚糖酯的酯化度为 16. 8 、 4 40. 酸 天津市巴斯夫化工有限 公司 AR 级 氯化亚砜、室温下 壳聚糖衍生物在蒸馏水及有机试剂中的溶解 苯甲醛、 吡啶、异丙醇及其它试剂均为分析纯。性比壳聚糖更好 产物的 T G 和 DT G 分析结果表明所 2. 2 主要仪器与设备制得壳聚糖酯的稳定性稍低于壳聚糖。另外 由于分 仪器: Avat ar 360 F T 2IR 型红外光谱仪 KBr 压子结构中两氨基的存在 其溶于弱酸性溶液后随着 片法 Nicolet 公司 美国 NH 3 的增多 使其在抑菌方面有更大优势。 声波KQ3200DE 型台式数控超形成 清洗器 昆山市超声仪器有限公司 带磁力搅拌关键词: 壳聚糖酯 氨基 有机可溶性 抑菌性 的 500mL 电加热套 ZK 82B 电热真空干燥箱 H H- 4 -中图分类号: T Q314. 2 文献标识码: A 型数显恒温水浴锅 F A2004N 电子天平 Varian INO-文章编号: 1001 9731 2011 增刊? 0839 06 - - - VA NM R 型核磁共振波谱仪 500MH z EL 元素分析仪 ST 1 WRT- 3P 热重分析仪。 -1 引 言 2. 3 对氨基美国 Vanio - 苯甲酸壳聚糖酯的制备 壳聚糖是白色无定型、 略有珍珠光泽的固 半透明、 2. 3. 1 壳聚糖与苯甲醛的缩合反应体 因原料和制备方法不同 相对分子质量也从数十万 一定量壳聚糖加至 3 冰醋酸中溶胀 30min 转移至数百万不等。壳聚糖不溶于水和碱溶液 可溶于稀 至 250mL 三口烧瓶中 加入 10m L 无水乙醇 搅拌 并的盐酸、 硝酸等无机酸和大多数有机酸 不溶于稀的硫 于恒压滴液漏斗中加入一定量已溶在 20m L 无水乙醇 1酸、磷酸 。壳聚糖的酰化反应是研究得较多的一种 中的苯甲醛 在一定温度下反应 5h 出现絮状固体 加反应: 通过导入不同分子量的脂肪族或芳香族酰基 所 入大量乙醇静置过夜 抽滤 用 20mL 乙醇和 20mL 乙得产物在有机芗林械娜芙舛瓤纱蟠蟾纳?2 。壳聚糖 醚洗涤 恒温干燥得到淡黄色固体即席夫碱。分子链的糖残基上既有羧基 又有氨基 因此 酰化反 2. 3. 2 对氨基苯甲酰氯的制备应既可在羟基上发生 生成酯 也可在氨基上发生 生 将一定量对氨 基苯甲 酸溶 于 60 e 热 水中 热抽成酰胺 3 。 滤 除不溶杂质 真空干燥后放入 250mL 三口烧瓶中 壳聚糖具有一定的抗菌强度和抗菌谱 同时壳聚 加入 30mL 无水乙醚 加入稍过量的氯化亚砜 在 30 e糖 C 6 位羟基具有一定活性。把壳聚糖当作多元醇 - 超声波洗涤 器中 超声震 荡 10m in 回 流反应 一段时对氨基苯甲酸作为酸 从理论上两者之间也能发生酯 间 冷却至室温 减压蒸馏 重结晶得到对氨基苯甲酰化反应 即壳聚糖与对氨基苯甲酸可合成得到对氨基 氯。苯甲酸 6 壳聚糖酯 4 5 这不仅可以在 一定程度上提 -- 2. 3. 3 席夫碱与对氨基苯甲酰氯的反应高壳聚糖溶解性 而且还可以在不破坏壳聚糖原有游 在 250mL 三口烧瓶中加入已制得的壳聚糖席夫离氨基的基础上 再增加氨基来达到增强抗菌活性的 碱 并加入一定量体积比 1 B 1 的异 丙醇和吡啶混合目的。 液 微加热搅拌一段时间 搅拌下缓慢滴加已溶入异丙 由于制备工艺复杂且产率较低 国内外对壳聚糖 醇的对氨基苯甲酰氯 转入 一定温度水浴中反应 3h酯的研究较少 对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备也尚未 反应液用 10 的 Na 2 CO3 调至中性 抽滤 用乙醇索氏见过报导。 提取 12h 抽滤 得到淡黄色产物。 2. 3. 4 氨基还原 将产品悬浮于 0. 25mol/ L 的 H Cl 和乙醇体积比 1 B4 的混合液中室温 搅拌 24h 加入 Na 2 CO 3 调 pH 基金 项目: 国家自然科学基金资助项目 41076065 国家重点 基础研究发展 973 计划 资助项目 2010CB428701 收到 初稿日期: 2011 01 23 - - 收到修改稿日期: 2011 09 16 - - 通讯作者: 王江涛 作者 简介: 王河东 1985- 男 山东烟台人 在读 硕士 主要从事壳聚糖方面的研究。 840 2011 年增刊? 42 卷值至中性 抽滤 用大量乙醇洗涤 真空干燥得产物对 分别放入热重分析仪中进行程序升温 保持 10 e / m in氨基苯甲酸壳聚糖酯。对氨基苯甲酸壳聚糖酯的合成 的速率 从室温升至 500 e 得到 T G 和 DT G 曲线。过程见图 1。 2. 5 抑菌实验 2. 5. 1 菌种 革兰氏阳 性菌 金黄色 葡萄 球菌 St aphylococcus aureus 和真菌黑曲霉菌 Aspergillus nig er 。 2. 5. 2 培养基 营养琼脂培养 基 培养细菌用 : 1000mL 肉汤培 养液中加入 15g 琼脂 加热 角瓶 封口 121 e 灭菌 20min 待用。 沙堡氏培养基 培煮沸使琼脂熔化 分装于三 养霉菌用 : 蛋白胨 10g 葡萄糖 40g 于 1000mL 水混合 不断搅拌使配料溶解 三角瓶 分装 封口 121 e 灭菌 20min 待用。 2. 5. 3 抑菌率 供试菌种 接入到相对应的 斜面培养基 上进行活 化。金黄 色葡 萄 球菌 置 于 37 e 恒温 培 养箱 中 培养 24h 黑曲霉菌置于 28 e 恒温培养箱中培养 7d。然后 分别挑取 1 环已活化 盐水中 振荡摇匀 制成一系列 的菌悬液。预实验好的菌种放入到 9m L 无菌生理 表 明 一定范围内 不同质量分数的乙酸溶液对细菌的生 长几乎不产生影响 因此 便于样品溶解 用质量分数 0. 5 的乙酸溶液作为溶剂。 对于金黄色葡萄球菌采用菌落计数法测定壳聚糖 和衍生物的抑菌率。配制不同质量分数的壳聚糖溶液 和衍生物溶液 0. 5 的乙酸溶液为溶剂 。分别将0. 1 mL 金黄色葡萄球菌菌悬液和 0. 1m L 不同浓度的样品 图 1 对氨基苯甲酸壳聚糖酯的合成过程 溶液均匀涂布在培养基平板上 空白为只加菌悬液而 -F ig 1 T he sy nt hesis of p aminobenzoy l chit osan ester 不加样品溶液。所有平板在 37 e 恒温培养箱中培养2. 4 产物的表征 24h 取出观察各个平板上的细菌生长情况 计算抑菌2. 4. 1 F T- IR 率。 利用 KBr 压片法 在 4000 400cm - 1 范围内分别 抑菌率的计算 6 : G N 1 - N 2 / N 1 100记录壳聚糖、 席夫碱、 对氨基苯甲酸壳聚糖酯的 IR 图 其中 N 1 、 2 分别为空白平板和涂有样品的平板 N谱。 上的菌落数。2. 4. 2 溶解性 对于黑曲霉采用干重法测定壳聚糖和衍生物的抑 室温下 将一定量壳聚糖和对氨基苯甲酸壳聚糖 菌率。配制不同质量分数的壳聚糖溶液和衍生物溶液酯分别加入到一定体积的水、 乙醇、 环己烷、丙酮、异丙 0. 5 的乙酸溶液为溶剂 。分别将 1mL 黑曲霉菌悬醇、二氯甲烷中 保持其浓度为 5mg/ mL 搅拌一段时 液和 2mL 不同浓度的样品溶液添加到液体沙氏培养间 观察其溶解效果。 基中 空白为只加菌悬液而不加样 品溶液 在 28 e 恒2. 4. 3 元素分析 温振荡培养 箱中培养 48h 抽滤、 干燥 并称重 菌体干 称取质量为 0. 8 1. 6m g 的 样品 经元素分析仪 重 计算抑菌率。进行测定 得到 P OC、 PON 的百分数 进而利用新推导 抑菌率的计算 7 : G W 1 - W 2 / W 1 100的单取代公式计算 得出对氨基苯甲酸壳聚糖酯的取 其中 W 1 和 W 2 分别为不加样品培养液中的菌丝代度 即酯化度。 重和添加样品培养液中菌丝重。 1 132. 4. 4 H NM R 和 C NMR 壳聚糖溶解在 D3 CCOOD 和 D2 O 的混合溶剂中 3 结果 与讨论而新制备的对氨基苯甲酸壳聚糖酯 D S 16. 8 样 3. 1 F T- IR 分析品溶在 D2 O 中进行测定。 图 2 为壳聚糖、席夫碱以及两种取代度的对氨基2. 4. 5 T G 和 DT G 苯甲酸壳聚糖酯的红外光谱图。 壳聚糖及对氨基苯甲酸壳聚糖酯 DS 16. 8 王河东 等: 对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备、表征及抗菌活性 841 1373cm 为 O H 弯曲振动 1159 和 893cm 为壳聚 - 1 - 1 - 1 糖基吸收带。而壳聚糖席夫碱的谱图 1639cm 谱峰 - 1 明显增强 代表 C N 的产生 3442cm 处谱峰明显 更加尖锐也表 示 N C 的 出现。761 和 688cm - 1 处峰是由于苯环中 C H 振动引起的。壳聚糖酯的 谱图在 1712cm - 1 处的微弱峰是酯化物中 C O 的伸 缩振动 1610cm - 1 处的新峰 是强氨基吸收 带 它随取 代度的增大而增大 1517cm - 1 处为新引进基团中芳环图 2 壳 聚 糖、 夫 碱 和 DS 16. 8 、 4 的 席 40. 骨架振动 吸收峰 1245cm - 1 处 为新合 成壳聚 糖酯中 ABCT SE 的红外光谱 C O C 的伸缩振动。证明 成功合成了对氨基苯甲Fig 2 FT- IR spectra o f chit osan Schif f base ABCT SE 酸壳聚糖酯。 DS 16. 8 40. 4 3. 2 溶解性和元素分析 图 2 中 1 处为酰胺 谱带 由于脱乙酰度 将壳聚糖与新制的对氨基苯甲酸壳聚1649cm - 糖酯分别加较高 峰较小 1597cm 处为强氨基 NH 2 吸收带 。 - 1 8 入几种 不同溶剂 使其浓度为 5mg/ mL 而由样品中 POC、 PON 的量 可 计算 出样品 的取代 度 也 即酯化 度 如表 1 所示。 表 1 对氨基苯甲酸壳聚糖酯元素分析结果与溶解性 T able 1 DS and sol ubilit y of ABCT SE in diff erent solvents 元 素分析 溶 C N DS 水 乙醇 环己烷 丙酮 异丙醇 二氯甲烷 壳聚糖 44. 82 8. 解性 样品 63 - - - - - - ABCT SE1 33. 76 6. 36 0. 168 - - - - - ABCT SE2 34. 02 6. 27 0. 404 - - - 注: : 可溶 - : 不溶 : 可溶或微溶 1 13 对于一元取代反应且取代物中含 N 3. 3 H NM R 和 C NMR 分析其取代度计算方法可通过新推导的有 C、 的产物 式 1 来进行: 壳聚糖溶解于 CD3 COOD 和 D 2 O 的混合物中 对 M N R - 8 - 2DD M C 氨基苯甲酸壳聚糖 D S 16. 8 溶于 D2 O 中 图 3 和 DS 1 nC/ N M C - M N R 4 分别为壳聚糖和壳聚糖酯的氢核磁共振波谱。由图 式 1 中 DS 为取代度 DD 为壳聚糖脱乙酰 度 3 表明 2. 02 10 处的小峰是由于 壳聚糖乙酰胺基 - 6M C 、 N 为碳、 M 氮原子的相对原子质量 nC/ N 是取代物中 中 CH 3 的存在所 引起的 由于脱 乙酰度较 高 峰较碳、氮的原子个数比 R 为元素分析结果中碳、 氮百分 小 而 2. 96 10 处的独立 峰归因于 H 2 的 存在 从 - 6含量比。 3. 50 3. 72 10- 6 各样品的峰与壳聚糖中 H 3 、 4 、 H 对于一元取代反应且取代 物中含 C 而不含 N 的 H 5 、 6 是完全一致的 在 4. 67 10 处的峰则是 H 1 H - 6产物 其取代度计算方 法可通过新推导 的式 2 来进 的作用 10 .