反相高效液相色谱法测定竹沥达痰丸中黄芩苷的含量

反相高效液相色谱法测定竹沥达痰丸中黄芩苷的含量 反相高效液相色谱法测定竹沥达痰丸中黄芩苷的 含量 ====================================================================== 【摘要】 目的建立反相高效液相色谱()法竹沥达痰丸中有效 成分黄芩苷含量的测定方法。方法采用HPLC法，色谱柱为ZORBAX 柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流动相为甲醇水磷酸 (47?53?0.2)，检测波长为316 nm。结果黄芩苷线性范围10.04,77.2 μg/ml，r=0.999 8 (n=7);回收率为100.5%(n=6)，RSD为1.22%。结论测 定方法简便、稳定，能有效地控制该制剂的质量。 【关键词】 竹沥达痰丸 黄芩苷 反相高效液相色谱法 Abstract:Objective To establish a measurement method of baicalin, the effective component of Zhulidatan Pills. MethodsThe isolation was conducted on a ZORBAX Extend-C18 column(4.6 mm×150 mm,5μm), the mobile phase consisted of methanol-water-phosphate(47?53?0.2), the detection wavelength was 316 nm. Results The content of baicalin showed good linearity in the range of 10.04,77.2 μg/ml，r=0.999 8 (n=7), and the average recovery was 100.5%(n=6), RSD was 1.22%. ConclusionThe method is simple,stable, and can effectively control the quality of the preparation. Key words:Zhulidatan Pills; Baicalin; RP-HPLC 竹沥达痰丸由黄芩、半夏、大黄、橘红、甘草、沉香等6味药材加工提取 制得的制剂，具有豁除顽痰，清火顺气的功效，用于痰热上壅，顽痰胶结，咳 喘痰多，大便干燥，烦闷癫狂等症状,1,。黄芩为方中主药，主要有效成分为 黄芩苷。《中国药典》2005年版?部竹沥达痰丸项下无含量测定项，为了提高 检测手段，有效地控制产品质量，本文建立了黄芩苷含量的高效液相色谱测定 法。 1 仪器与试药 1.1 仪器 Agillent 1100高效液相色谱仪(美国)，ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱，G1379A四元泵，G1314A VWD 检测器，G1316A 恒 温箱，G1313A ALS 自动进样器。Mettler Toledo PB1502-S 电子天平， Mettler Toledo AG204电子分析天平，超声处理器(上海船舶电子设备研究 所)。 1.2 试药 黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号，供含量测定用);甲醇(色谱纯);其余试剂均为分析纯;水为双蒸水。 1.3 样品 竹沥达痰丸(某药厂批号20060703，20060910，20061112)。 2 方法与结果 2.1 色谱条件与系统适用性实验 用十八烷基键合硅胶为填充剂;以甲醇,水,磷酸(47?53?0.2)为流动相;检测波长316 nm;柱温室温。理论板数按黄芩峰计算应不低于3 000。 2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取在60?减压干燥4 h的黄芩苷对照品适量，加50%甲醇制成每毫升含30 μg 的溶液，即得。 2.1.2 供试品溶液的制备 取丸剂，研细，精密称取1.8 g置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，称定重量，超声处理(功率320 W,频率35 kHz)20 min，放冷，再称定重量， 甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液1 ml，置10 ml量瓶中，用50% 用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 2.1.3 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20 μl ，注入液相色谱仪，测定，即得。 2.2 检测波长的确定 以50%甲醇水为空白，对黄芩苷标准溶液进行紫外扫描，结果明黄芩苷在280 nm及316 nm处有最大吸收，重复测定其在316 nm处的吸收度，结果表明在316 nm处测定稳定性好，因此液相色谱法中吸收波长确定为316 nm。见图1,2及表1。表1 黄芩苷标准溶液在λ,316 nm处重复测定的吸收度(略) 2.3 线性关系考察 对照品溶液的制备:精密称取在60?减压干燥4 h的黄芩苷对照品19.3 mg，置于250 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为77.2 mg/ml的黄芩苷标准品储备溶液，然后依次精密量取浓度为77.2 mg/ml的黄芩苷标准储备溶液1.3，2.6，4.0，5.2，6.5，8 ml于10 ml容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为10.036，20.072，30.88，40.144， 50.18，61.76，77.2 mg/ml的系列黄芩苷标准溶液。按上述色谱条件分别精密吸取标准品溶液各20 μl进样测定，以色谱峰面积为纵坐标，样品浓度为横坐标回归得标准曲线为:A=40.781C-8.699 8 ，r=0.999 8。表明在浓度10.04,77.2 μg/ml范围内黄芩苷的峰面积与浓度线性关系良好。黄芩苷标准曲线见图3。 2.4 精密度实验精密吸取供试品溶液20μl进样测定，一天内重复进样操作6次，约1 h/次，测得各次峰面积分别为1953.5，1946.2，1929.4，1931.3，1893.2，1878.5计算峰面积的RSD为1.47%，表明样品利用该方法一天内测定精密度满足要求，但含量有下降趋势，提示样品处理后应尽可能短时间内进行分析。 2.5 专属性实验制备缺黄芩的阴性样品，然后同供试品溶液样品处理法同法处理，得到黄芩阴性溶液。分别精密吸取阴性溶液、标准品溶液、供试品溶液20μl，进样测定，色谱图，见图4,6。 从色谱图中可看出阴性样对测定无干扰，制剂中黄芩苷与相邻峰分离良好，理论板数可达3 000以上。表明此液相色谱法测定制剂中黄芩苷的专属性良好。 2.6 加样回收率实验按半量加入法进行加样回收率的测定，因本品黄芩苷含量较高，为节省标准品，样品及溶剂按比例缩小至1/5，另外黄芩苷在水、甲醇等溶解度均较小，在50%甲醇,水中的溶解度有所增大，我们在实验研究过程发现以50%甲醇,水为溶剂时，当浓度为300μg/ml时，溶液已呈混悬状，因此加样回收率测定中加入浓标有困难，故我们采取的是用提取溶剂量的50%甲醇,水溶解标准品，然后加入丸剂处理后的粉末中进行样品提取，具体操作如下:精密称取研细的丸剂粉末约0.2 g共6份(批号050401)，置具塞锥形瓶中，各精密加入以50%甲醇-水溶解的浓度为200.6 μg/ml的标准品溶液10 ml，称定重量，超声处理(功率320 W,频率35 kHz)20 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液1 ml，置10 ml量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件测定，并按下式计算加样回收率。 加样回收率(%)=(W2-W1)/W0×100% 式中:W2,测得总量 W1,供试品中黄芩苷已知量 W0,黄芩苷标准品加入量 结果见表2。表2 丸剂测定的加样回收率(略) 上述加样回收率实验表明利用本方法测定丸剂的黄芩苷含量准确度高，样品处理方法可行。 2.7 样品的含量测定利用该方法测定3批样品。结果见表3。表3 竹沥达痰丸中的黄芩苷的测定结果(略) 3 讨论 3.1 检测波长的确定 对黄芩苷标准溶液进行紫外扫描结果表明黄芩苷在280 nm及316 nm处有最大吸收，且在316 nm处测定稳定性好，因此吸收波长确定为316 nm。 3.2 加样回收率方法的研究 黄芩苷在水、甲醇等溶解度均较小，在50%甲醇水中的溶解度有所增大，实验研究发现以50%甲醇水为溶剂时，浓度为300 μg/ml时，溶液已呈混悬状，所以加样回收率测定中加入浓标有困难，故我们采取的是用提取溶剂量的50%甲醇水溶解标准品，然后加入丸剂粉末中进行样品提取。 3.3 流动相的选择 参照《中国药典》2005年?部各种黄芩苷测定方法，分别采用流动相甲醇水冰醋酸(40?60?1)、甲醇-水-冰醋酸(50?50?1)、甲醇-水-磷酸(43?57?0.2)、甲醇-水-磷酸(40?60?0.2)进行实验。结果,在甲醇水磷酸(43?57?0.2)为流动相的条件下，样品分离度良好。 3.4 提取时间的确定 参照《中国药典》2005年?部黄芩项下的超声提取方法。分别以50%甲醇，70%乙醇及稀乙醇(53%)作为提取溶媒进行超声处理实验，结果50%甲醇提取效果较好。故选择为50%甲醇提取溶媒的提取方法。取本品，研细，精密称取约2 g的量，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，称定重量，分别以20，30，40 min进行超声处理。按上述色谱条件测定，结果显示4个结果差别不大，因而采用提取时间20 min。 【参考文献】 ,1,国家药典委员会. 中国药典，?部,S,.北京:化学工业出版社，2005:438.