无线磁弹性传感器检测生殖支原体和痕量汞（可编辑）

无线磁弹性传感器检测生殖支原体和痕量汞（可编辑） 无线磁弹性传感器检测生殖支原体和痕量汞 、 南华大学学位论文原创性声明 本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外,论文中不包含其他人已经发或撰写过的研究成果,也不包 含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名:街埒 如。年月日 南华大学学位论文版权使用授权书 本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有 权保留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论 文的全部或部分内容,可以编入有关数据库进行检索,可以采用复印、 缩印或其它手段保留学位论文;学校可根据国家或湖南省有关部门规 定送交学位论文。对于涉密的学位论文,解密后适用该授权。 作者签名:衙博 导师签名: 彦力犬 ‖ 如年月日 矽护口尸年厂月/日目 录 主要缩写符号与对照?? 中文摘要? 英文摘要? 第一章前言 研究意义??.:??. 无线磁弹性传感器基本原理 无线磁弹性传感器应用研究进展? 本研究的主要内容和创新之处? 第二章 无线磁弹性传感器监测生殖支原体生长过程及评价抗生素 抑菌效果 引言 材料与方法 结果与讨论 结论 第三章无线磁弹性免疫传感法定量测定生殖支原体 引言 实验部分? 结果与讨论?..,?. 结论第四章催化沉淀无线传感法测定痕量汞 引言 实验部分? 结果与讨论 结论 参考文献.’??.. 综述已/待发表的论文 致谢?主要缩写符号与对照 缩写符号 英文名 中文名称 牛血清白蛋白 颜色改变单位法 /抑制率 生殖支原体 最低抑制浓度聚合酶链式反应磷酸缓冲液 聚乙烯基亚胺 无线磁弹性传感器检测生殖支原体和痕量汞 研究生:何博 导师:廖力夫教授 专业:卫生毒理学 中文摘要 本文在前言部分概述了微生物支原体的特性和危害性,并概述了监测支原体 生长过程和快速测定支原体的研究进展,同时概述了环境污染物汞的危害性 和检 测研究进展。然后介绍了无线磁弹性传感器的基本结构和工作原理,综述了 无线 磁弹性传感器的应用研究进展。另外,对本文提出的无线磁弹性传感器检测生殖 支原体和汞的新方法也进行了概述。 第二章介绍了用无线磁弹性传感器实时、长期和原位监测生殖支原体的生长 过程,以及用无线磁弹性传感器评价抗生素四环素和左氧氟沙星对生殖支原体生 长的抑制效果。生殖支原体是无细胞壁的体积最小且结构最简单的支原体,是可 引起人类多种疾病的病原体。无线传感器是由铁合金磁条带切割而成的矩形磁振 片,表面涂一层聚氨基甲酸酯保护膜。在外加交变磁场的作用下,被感应的传感 器发生纵向共振,并发射出可由检测系统进行无线检测的共振磁场信号。传感器 与检测系统无需任何物理连接,这一特性有利于实现生殖支原体培养过程的无菌 操作。生殖支原体粘附在传感器表面生长使传感器共振频率下降,下降值与生殖 支原体的数量有线性关系。由频移值.时间曲线的变化情况可以看出生殖支原体 在正常培养情况下生长曲线由三个部分组成,分别是生长迟缓期、对数生长 期和 稳定期。在抗生素存在的情况下,生长曲线的迟缓期明显延长,并且稳定期被衰 退期取代。抗生素对的抑制效果与其浓度有关。加入抗生素培养小时的 情况下,四环素的抑制%的最低抑制浓度为. /,左氧氟沙 星的为.“/。 第三章介绍了应用一种无线磁弹性免疫传感器测定生殖支原体的新方法,并 描述了该免疫传感器的构建。在该方法中,用戊二醛交联法将生殖支原体抗体固 定在传感器表面。生殖支原体与抗体特异性结合粘附于免疫传感器上,导致磁弹 性片共振频率降低。共振频率的变化值与生殖支原体的浓度相关。研究了聚乙烯 亚胺用量、戊二醛用量、反应时间和温度等因素对测定的影响。在最佳条件下,测定生殖支原体的线性范围为.~. ~,检出限为. 一。应用本方法测定了样品中生殖支原体的浓度,测定结果与颜色改变单位法 一致,结果满意。 第四章介绍了催化沉淀法测定痕量汞的新方法。基于汞对瞄与 ?的沉淀反应的催化作用和沉积于磁弹性片上的沉淀导致的磁弹性片共 振频率的降低,建立了应用磁弹性传感器的催化沉淀无线传感法测定痕量汞 的方 法。磁弹性传感技术具有能无线检测磁弹性片的共振频率变化的独特性质, 这种 共振频率变化对应于磁弹性片的质量变化。研究了酸度、试剂用量等多种因 素对 和乙酸的浓度分别为.、.和. 测定的影响。在瞄、 /,反应温度和时间分别为?和 的条件下,测定汞的线性范围为 .. /,检出限为.肛/。应用本方法测定了水样中的痕量汞,回收率 为.%.%。 关键词:磁弹性传感器;无线;生殖支原体;四环素;左氧氟沙星;汞;催化沉 淀,..仃, . . ?, ?,?缈. 撕 . . 、析, ? . ,. . , .,., .. .,惭 .、柝. ., ,. , .~. 。 .×~.‘. 埘 . ., ., . . , ., .. ,. /,, 。 衄, ..肛/ .肛/..%~ .%. : ; ;;; ;; :. 第一章前 言 研究意义 支原体是可在细胞外生存的可自我复制的最小微生物,是 一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物,大小一般在...岫之间,呈高度多形 性,有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于一般细菌,也不同于 病 毒。目前发现的支原体有多种,分布广泛,且多数都对人畜有致病性,造成 的危害相当大。其中可使人致病的有余种,给人类健康带来严重危害【】。 寄生于人体内的支原体通常粘附并寄居在呼吸道或泌尿生殖道上皮细 胞上或寄居于细胞内部。目前从人体分离得到的致病性支原体主要有肺炎支原 体.、解脲支原体 、人型支原体 .、生殖支原体.、穿透支原体.等【】。 其中肺炎支原体主要寄居于呼吸道和肺部,其余支原体则主要寄居于泌尿生殖 道。已有研究表明这些支原体与多种疾病有关,如肺炎【】、盆腔感染嗍、泌尿生 殖道感染【、不育不孕症【】、自发流产【等。已有研究还表明这些支原体是 的协同致病因子【一。支原体引发疾病的方式主要是通过多种不同机制引起细胞 损伤,如获取细胞膜上的脂质与胆固醇造成膜的损伤,释放神经毒素、氨、 磷酸酶及过氧化氢掣】,从而引发各种各样的疾病 有关支原体致病具体机制的研究和源于支原体的疾病的防治研究都是 目前的热点研究问。要进行这些研究,必须要有能有效监测支原体生长过 程的方法。通过对支原体的生长过程进行实时监测,可以直观了解支原体生长 过程中各阶段的生长特点和致病机制。在支原体生长过程中加入抗生素对其 进行 生长抑制实验,则可通过实时监测抑制生长的过程来研究不同生长阶段药物对支 原体的抑制情况,并对不同抗菌药物的抑制效果进行评价,为筛选合适的抗菌药 物提供依据。同时,要检查患者是否受到支原体的感染,还必须要有能快速定量 检测出支原体的有效方法。 目前,用于实时监测微生物的生长增殖情况的方法主要有:流式细胞计量术【、石英晶体微量天平【.、声波阻抗技术四和电化学传感器【 】等。这些方 法在实际运用中都有各自的优势,为监测微生物生长情况提供了不同的监测手 段。但这些方法在运用过程中传感器与检测仪器之间必然存在某种物理上的连接 如排线,这给实时监测在实际运用中带来一定的局限性,不利于无菌操作和 密闭容器内微生物生长监测,而且有些方法的仪器费用比较高。菌落计数法【】 和颜色改变单位法 ,】在细菌检测方面也有应用,但 这些方法不能跟踪监测细菌的生长过程,有的方法不能用于检测支原体这种缺乏 细胞壁的细菌,如菌落计数法。因此建立一些能更有效地监测支原体生长过程的 新方法具有重要意义。 近些年来对支原体的定量检测较多采用免疫标记技术和分子诊断技术,分子 诊断技术多以和 基因序列为目的基因进行聚合酶链反应 扩增或进行核酸序列测定分析。主要的方法有免疫荧光显微技术【、免疫印迹 法、探针技术、聚合酶链式反应技术【、扩增片段长度多 态性分析、法【】等。这些方法广泛应用于支原体的定量检测中,具有灵敏度高,特 异性强的特点。但大多检测过程操作繁琐,用时较长,不利于快速定量分析。因 此建立一些更加快速方便的支原体定量检测方法具有很大意义。 汞是对人类健康危害极大的剧毒重金属元素【】。因此判断环境中的汞污染 情况具有极重要的意义。人类活动造成的环境汞污染,主要来自氯碱、塑料、电 池、电子等工业排放的废水。据估计,~年全世界由于人类活动直接向 水体排放汞的总量约.万吨;排向大气的总汞量达万吨左右;排入土壤总汞 约为万吨【引。在环境中的汞可直接或间接地在微生物的作用下转化为甲基 汞。甲基汞等各种形态的汞可通过水体及食物链进入人体并在体内积累而危害 人体。日本的水俣病,就是在大脑中累积了甲基汞,损害脑组织所致【。在人 体其他组织中的金属汞,还可氧化成离子状态,并转移到肾中蓄积起来。人体受 汞慢性中毒的临床表现,主要是神经性症状,有头痛、头晕、肢体麻木和疼痛、 肌肉震颤、运动失调等【】。这类病有严重的后遗症和较高的死亡率,还可以通 过母体遗传给婴儿。因此对环境中的痕量汞进行检测极为重要。 目前测定痕量汞的方法主要有原子荧光法【、原子吸收法【、等离子体电 感耦合质谱法【.和催化光度法【等,各种方法在实际运用中各有优点,如 灵敏度高,检出限低等。但大多方法操作不便,检测条件要求较高。因此研究 更简便易行的测定痕量汞的新方法具有一定意义。 基于磁弹性传感元件的无线磁弹性传感检测方法是一种传感元件不与检测 器直接相连的遥感检测方法。由于传感元件可远离检测器,因此无线磁弹性传感 检测方法可克服有线传感检测方法的一些固有缺点,并具有一些显著的优点。如 无线传感检测方法可避免测试人员与检测对象直接接触,有利于无菌操作和对密 闭容器中的物质进行检测,并且操作简便,检测成本低等。因此研究支原体和汞 的无线传感检测方法具有重要意义。 无线磁弹性传感器基本原理 无线磁弹性传感器是以具有磁致伸缩性的合金材料磁弹性材料为传感 元件的传感器【。在这种传感器中,传感元件是由非晶态铁基合金软磁材料如 、..等构成的膜片,即磁弹性传感片,亦称磁振片。在 外加交变磁场中,磁弹性传感片受磁场激发产生磁矩并发生伸缩振动磁致伸 缩,其伸缩振动产生的磁通可由磁场检测仪器进行无线检测。 .磁致伸缩效应 当磁振片在磁场中被磁化时,其长度、宽度和体积将发生变化,这种现 象就是磁致伸缩现象,又称磁致伸缩效应【。长度、宽度和体积的磁致伸 缩效应分别称为纵向磁致伸缩,横向磁致伸缩和体积磁致伸缩。当磁振片的 长度显著大于宽度和厚度时,则纵向磁致伸缩是主要的磁致伸缩效应,表现 为材料在磁化过程中沿长度方向进行伸长或缩短。纵向磁致伸缩又称为线 磁致伸缩。磁致伸缩是可逆的,外加的磁场越强,则磁致伸缩越显著。当 外加的磁场撤除后,磁振片又恢复原态,即磁致伸缩现象消失。 磁致伸缩材料的线磁致伸缩能力可用线磁致伸缩系数九表示: :翌 三 上式中三为磁致伸缩材料的长度,为在一定强度的磁场中材料在长度三 方向上的变化量。当珍时,为正线磁致伸缩,表示磁致伸缩材料沿磁场表示磁 系数九 的大小一方面取决于材料本身性质,另一方面还与外加磁场的大小有关。 外加磁场越大,线磁致伸缩系数九就越大,相应的磁致伸缩效应就越显著。 .磁致伸缩机理 磁振片的磁致伸缩起源于原子或离子的自旋轨道耦合与轨道耦合相叠 加。磁致伸缩现象的产生是由于体系要满足能量最小最稳定条件的必然结 。 果,如果铁磁晶体的变形能够导致其总能量减小,这种变形就会产生【, 一般认为,铁磁或亚铁磁材料在居里点以下发生白发磁化,形成大量磁畴。 在每个磁畴内,晶格都发生形变,其磁化强度的方向是自发形变的一个主 轴。未加外磁场时,磁畴的磁化方向是随机取向的,总磁矩为零,无宏观 磁致伸缩效应,如图.。 图.磁至伸缩机理 . 饱和磁化状态 退磁状态 外加磁场后,材料内部随机取向磁畴发生偏转,使各个磁畴的磁化方 向与外磁场方向一致,从而产生宏观磁致伸缩效应,如图一。如果晶体 材料 .磁致伸缩材料 磁致伸缩材料是指磁致伸缩系数九值较大的材料。自从焦耳发现铁棒 的纵向磁致伸缩效应后,人们就一直利用这一物理效应来制造有用的功能 器件与设备。为此人们研究和发展了一系列磁致伸缩材料。磁致伸缩材料 大致以三大类为主: 磁致伸缩的金属与合金,如镍基合金,.,..和 铁基合金如.,.,..等。 铁氧体如.,..铁氧体材料等磁致伸缩材料。 近期发展的以...材料为代表的多元素金属间化合物磁致 伸缩材料。 金属磁致伸缩材料九比铁氧体磁致伸缩材料大至倍。但由于这两种材 料的九值过小,都没有得到推广应用。多元素金属间化合物磁致伸缩材料九 比金属与合金磁致伸缩材料和铁氧化磁致伸缩材料的大~个数量级,被 誉为世纪的战略性功能材料,在军民两用高技术领域有广阔的应用前景。 .无线磁弹性传感器的基本结构和检测原理 无线磁弹性传感装置由信号激发部分、磁弹性传感片和信号检测部分三部 分构成图.。该装置的信号激发部分和信号检测部分在实际中可组装在 一起。 信号发生器 检测线圈 融接线圈 图.无线磁弹性传感装置示意图 . . 磁弹性传感片在外加磁场下的磁致伸缩是可逆的。当外加磁场是一个磁场强 度和方向随时间变化的交变磁场时,磁弹性传感片应会发生机械性的磁致伸 缩振 动,其振动频率和振动强度即振幅一方面与外加交变磁场的频率和强度有关, 另 一方面还与磁弹性传感片自身的材质、质量、大小、形状及所处的环境有关。 当 外加交变磁场的频率与传感片的固有机械振动频率相等时,传感片产生共振,此 时具有最大振幅。根据电磁学原理,磁弹性传感片在外加交变磁场的激发下发生 机械性的磁致伸缩振动时,又会同时发射出一个次生的感应交变磁场信号,这一 发射磁场信号可由磁场检测仪器进行无线检测。传感片产生的伸缩振动还可通过 声波和激光进行检测【。 在对磁弹性传感片的磁致伸缩振动进行检测的几种方式中,以用磁场检测仪 器进行无线检测的方式较为简便。在这种无线传感检测方法中,磁弹性传感片中 信号的激发是通过磁场进行的,信号的传送则可通过磁场、声波和激光进行,传 感元件与检测器之间没有任何物理连接,从而可实现遥感检测。本研究采用的检 测方式是用磁场检测仪器进行无线检测的方式。图.是本研究所用无线磁弹 性传感装置的示意图。该装置的信号激发部分和信号检测部分是组装在一起的。 磁弹性片 图.本研究的无线磁弹性传感装置示意图 .? 在外加交变磁场激励下,传感片产生伸缩振动,其振动方程可表示为【】:, , 一仃 式中,,力是传感片沿长度方向的位移速度,是杨氏弹性模量,盯是泊松比, 船是传感片材料密度。 当传感片发生共振时,对于长度为三的传感片,其共振基频频率月可由下式 给出【加】: ?? 当质量为的传感片表面负载质量改变时,则引起的频移?为【】: :?:一 当某被测物的含量在一定条件下与存在定量关系时,则可根据频移值利 用上式对其进行定量检测。 当将材料密度和厚度分别为风和的传感片置于密度和粘度分别为户,和叩 的液体中时,则引起的频移?,为【】: ?一巫?,磅 当某被测物的含量在一定条件下与粘度叩存在定量关系时,则可根据频移值 利用上式对其进行定量检测。 无线磁弹性传感器应用研究进展 磁弹性传感片的共振频率一方面与其自身的材质、大小和形状有关,同时还 所其装载的物质的质量、厚度、粘弹性及所处的环境因素有关。通过对共振 频率 和幅度的变化测量可以对多种物理量、化学量及生物和生化物质的检测。无 线传 感的无线优势使得其具有了广泛的应用价值,因此近年来有关无线磁弹性传感器 的应用研究受到了不少研究者的关注,并取得了一系列的研究成果。 .物理量检测应用 ..无线磁弹性温度传感器。磁振片的一方面其磁性与温度有关,随温度 而变化,另一方面其大小、体积也与温度有关,随温度而变化。因些磁振片的共 振频率将随温度而变化,从而可根据磁振片共振频率的漂移对温度进行测量【羽。 ..无线磁弹性湿度传感器。在磁振片的表面复盖一层二氧化钛膜可制成 无线磁弹性湿度传感器。当湿度增加时,水蒸气被吸入二氧化钛层,使传感器的 质量增加,导致其共振频率下降,从而可对湿度进行无线定量测定。类似于二氧 化钛,也可在磁振片的表面复盖氧化铝等其他可吸收水蒸气的物质制成相应的无 线磁弹性湿度传感器【,伽。 ..无线磁弹性压力传感器。平板型磁振片在外加交变磁场下发生的主要 纵向振动,因此对压力变化不太敏感。但若将磁振片制成弯曲型,则可获得灵敏 一 的无线磁弹性压力传感器【件】。无线磁弹性压力传感器具有广泛的应用前 景。 ?‘。‘。。。。‘‘’‘ ..无线磁弹性液体粘度传感器。根据式.可制成灵敏的无线磁弹性液 体粘度传感器。用这种传感器测量甘油等液体的粘度可得到很好的结果掣】。 .化学物质检测应用 ..无线磁弹性气体传感器。将一层聚丙烯酸.异辛基丙烯酸酯 巧 .?.修饰到磁弹性膜片表面便可构成无线磁弹 性传感器,该传感器的频移与的浓度存在定量关系【引。在一定条件下, 该传感器测定时,当浓度小于. %时呈良好的线性关系,大于. %时则呈对数关系,检测下限为. %。用该传感器无线检测具有很好 的应用前景。基于类似的原理,可以设计检测的无线磁弹性传感器。将丙烯 酰胺与异辛基丙烯酸酯发生反应生成聚丙烯酰胺.异辛基丙烯酸酯 ?,再将该聚合物修饰在磁弹性膜片上,即 制备成检测的无线磁弹性传感器【。 ..无线磁弹性传感器。基于值响应的磁弹性传感器是通过合成一种 对溶液:值敏感的聚合物由物质的量的比为:的丙烯酸与异辛基丙烯酸酯 发生共聚反应制得,并将此聚合物固定在传感器表面制成传感器【,。当 溶液的值随着化学或生物体系发生的反应而发生变化时,固定在传感器表面 的敏感膜会发生相应的收缩或膨胀,从而导致传感器表面负载质量减小或增 加,传感器共振频率也随之发生改变。利用该传感器能对一些有值变化的 体系进行检测。 .生物物质、生化物质和生化过程检测应用 ..无线磁弹性血凝传感器。血液凝集时间是医学检测的一个重要基本项 目。用于测量血液凝集时间的常规方法一般比较复杂,且准确性差。将无线磁弹 性传感器用于血液凝集时间的检测则是一种非常简便的新方法【。将磁弹性传 感器放入血液中,血液的凝集过程会引起血液黏度的不断变化,从而传感器的共 振频率也不断发生变化。因此通过使用这种传感装置能够连续测量血液凝集的整 个过程。通过测量随时间变化的信号输出,可以很清楚的知道血液凝集的概况。 葡萄糖传感器,磁弹性【.淀粉酶传感,磁弹性胰蛋白酶传感器,磁弹性酸性磷酸 酯酶传感器等。,】等以磁弹性传感器为基础,在敏感聚合物上再涂上 一层葡萄糖氧化酶与过氧化物酶,就制得磁弹性葡萄糖传感器。葡萄糖在葡萄糖 氧化酶作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢,生成的过氧化氢进一步被过氧化物酶氧 化为氧气和水,促使溶液值减小引起敏感聚合物膜发生质量变化,使传感 器共振频率增加,从而可对葡萄糖进行定量测定。类似的,在敏感膜上涂上 一层胰蛋白酶,则可制得测定胰岛素的磁弹性传感器。其原理同样是胰蛋白 酶水 解溶液中的胰岛素生成矿使溶液变小而最终导致传感器共振频率变化,从而 可对胰岛素进行测剧”】。磁弹性【.淀粉酶传感器表面固定了一层淀粉凝胶,在. 淀粉酶水解淀粉过程中导致传感器表面固定的淀粉质量减少,从而导致传感器共 振频率增加。该传感器可用于检测.淀粉酶及该酶的抑制物【】。磁弹性酸性磷酸 酯酶传感器检测原理是以一溴一.氯..吲哚磷酸酯为底物,经酸性磷酸酯酶水解 后生成的二聚物沉淀能紧密附着在传感器表面,导致传感器共振频率发生变化, 变化幅度正比于酸性磷酸酯酶的浓度【,从而可对酸性磷酸酯酶进行定量测定。 ..无线磁弹性免疫传感器。无线磁弹性免疫传感器主要有两种类型。一 种类型是将抗体固定在传感器表面,当被测抗原与抗体特异性结合后,使传感器 质量增加而发生共振频率的变化,从而可对抗原进行检测。这种类型适用于细菌 等具有较大体积和质量的抗原,或具有较高浓度的抗原。另一种类型是采用三明 治型,即将非标记抗体固定在传感器表面,被测抗原与传感器上的抗体结合 后, 再与一种酶标记抗体结合,标记抗体上的酶可催化底物反应生成沉淀沉积于传感 片上,使传感片的共振频率下降,从而可对抗原进行定量测定。这种方法灵敏度 高,但操作相应较复杂。等【】用葡萄球菌的型肠毒素抗体和碱性磷酸酯酶 标记抗体研究了三明治型的无线磁弹性葡萄球菌免疫传感器,取得了很好的结 果。类似的三明治型免疫传感器还有基于抗大肠杆菌抗体和碱性磷酸酶标记抗体 的无线磁弹性无线磁弹性大肠杆菌免疫传感器【】,基于抗篦麻蛋白抗体和碱性 磷酸酶标记抗体的无线磁弹性篦麻蛋白免疫传感器例等。 ..无线磁弹性微生物和细胞传感器。与蛋白质等分子相比较,微生物和 细胞具有更大的体积和质量,因此特别适于用无线磁弹性传感器进行检测,而且 检测时可完全避免直接接触带来的污染。无线磁弹性微生物和细胞传感器一般有 三种类型。第一种类型是利用微生物和细胞可直接粘附在传感片上的特点,用磁 弹性传感器对微生物和细胞进行直接检测。这种类型特别适于对微生物和细胞的 生长和抑制过程进行实时、长期和原位监测,其不足之处则是特异性较差。第二 种类型则与上述的第一种类型的免疫传感器一样,抗原则限定为微生物和细胞。 这种类型特异性好,检测速度快,但不适宜于对微生物和细胞的生长过程进行监 测。第三种类型则与上述的第二种类型的免疫传感器一样,抗原也只限定为微生 物和细胞。这种类型特异性好,灵敏度高,但操作相应复杂,也不适宜于对微生 物和细胞的生长过程进行监测。目前已有一些无线磁弹性微生物和细胞传感器的 研究报道。如用无线磁弹性传感器检测葡萄球菌【、大肠杆菌四、胸腺肿瘤细 胞【、假单胞菌【叫等。 尽管无线磁弹性传感器的应用研究在近年来己取得了很大进展。但应用无线 磁弹性传感器对支原体的检测研究和对环境有毒重金属的检测研究却还未见其 他文献报道。生殖支原体是种具有代表性的致病支原体,汞是一种具有代表性的 环境有毒重金属。为此本文开展了无线磁弹性传感器检测生殖支原体和痕量汞的 研究,并到得了很好的研究结果。 本研究的主要内容和创新之处 .主要研究内容 本研究的主要内容可分为三个部分,分列为三章。 在论文的第二章,研究了用无线磁弹性传感器实时、长期和原位监测 生殖支原体生长过程及评价抗生素抑制效应的新方法。在该方法中,将修 饰好聚氨酯保护膜的磁弹性传感器置于含有生殖支原体的液体培养基中, 便可对生殖支原体生长情况进行实时原位监测。这种方法是基于生殖支原 体在传感器表面粘附生长可导致传感器表面质量增大,从而使其共振频率 减小的原理进行的。在研究中同时用传统的比色法对生殖支原体的生 长情况进行了监测,结果与传感器频率响应一致。另外还研究了两种抗生一 ?。。。。。。‘‘‘‘‘‘‘‘‘。。。‘‘。 素四环素、左氧氟沙星对生殖支原体的抑制作 用,并对两种抗生素的 抑制效果进行了评价。 在论文的第三章研究了用无线磁弹性免疫传感器检测生殖支原体含量 的新方法。基于的原理。该方法是在传感器表面固定一层聚乙烯亚胺膜,用 戊二醛交联法将生殖支原体抗体固定在传感器表面制成无线免疫传感器, 检测时使生殖支原体与传感器表面上的抗体特异性结合,使传感器表面负 载质量增大,从而导致传感器共振频率减小。一定条件下传感器的共振频 率下降值与样品中生殖支原体的浓度有线性关系,从而实现了对生殖支原 体的定量测定。 在论文的第四章研究了催化沉淀无线磁弹性传感法测定痕量汞的新方 法。这种方法以汞对瞄?与 的沉淀反应的催化作用为基础。 催化反应产生的沉淀可沉积于磁弹性片上导致磁弹性片的质量增加,从而使其共 振频率的降低,一定条件下共振频率的降低值与汞的浓度存在定量关系,从而实 现了对痕量汞的定量测定。 .研究的创新和特色 本研究的创新和特色主要有以下几点。 本研究首次将无线磁弹性传感器用于生殖支原体生长过程的监测。这种 监测方式可非常方便地实现对支原体生长过程的实时、长期和原位监测,有利于 研究支原体的生长机制,这是其他监测方式难以达到的。同时,这种监测方式是 没有任何物理连接的无线监测,可实现真正意义上的无菌操作,有效避免了支原 体在培养生长过程中极易受杂菌污染而导致培养失败的现象。 应用无线磁弹性传感器可方便地研究抗生素等药物对支原体的抑制效 果和作用机制,有利于防治支原体感染的药物的筛选。 本研究首次研制了无线磁弹性生殖支原体免疫传感器。这种传感器操作 简便,为生殖支原体的快速检测提供了一种新途径。 生殖支原体是一种具有代表性的支原体。本研究建立的对生殖支原体进 行无线传感监测方式可推广应用到其他支原体,并扩展无线磁弹性传感器的 应用 范围。 本研究首次将汞的催化沉淀反应与无线检测方法相结合,建立了测定痕 量汞的催化沉淀传感检测新方法,为痕量汞的检测提供了一种简便的新途径。 很多金属离子都具有催化活性,汞只是其中的一种。根据本研究的思路, 还可建立催化沉淀传感检测法测定其他具有催化活性的金属离子,并且同样可扩 展无线磁弹性传感器的应用范围。 第二章无线磁弹性传感器监测生殖支原体生长过程 及评价抗生素抑菌效果 引言 支原体是一种介于细菌和病毒之间的原核微生物,有细胞 样的结构,由柔软的膜样结构包裹,但缺少细胞壁,能独立复制【】。有些支原体 寄生于人和其他灵长类动物的泌尿生殖道和呼吸道黏膜中,依靠高度特异的寄生 机制包括独特的顶端细胞器移植并侵入到人类细胞。因为缺乏细胞壁,支原体对 一些抗生素有耐药性,比如支原体对青霉素和头孢菌素类抗生素不敏感。生殖支 原体 ,是其中最小的一种支原体,细胞直径只有 /,其基因组大小约为 】。脯一个特殊的黏附顶端结构,依赖其特殊 的顶端结构黏附在人类泌尿生殖道上皮细胞上,此还有粘附玻璃、塑料器 皿和滑行运动的能力【“石。是一种人类致病性微生物,能引起尿道炎【,引、 宫颈炎【删、子宫内膜炎四和不孕不育症【】。 通过研究的生长抑制过程我们可以掌握在培养过程中各个阶段的生 长机制及特点,可直观的了解各种抑制药物对生长过程中各阶段的抑制效果, 为筛选合适的抗菌药物提供依据。这就需要一种能实时并长时间监测尥正常生 长及药物抑制生长情况的有效监测方法。目前,许多方法已被用于监测微生物的 生长增殖情况,如流式细胞计量术【】,石英晶体微量天平‘州】,声波阻抗技术四, 和电化学传感器【】等。这些方法都很有价值并有各自的优点。但这些方法在应 用过程中传感器与检测仪器之间必然存在某种物理上的连接如排线,这给实 时监测在实际应用中带来一定的局限性。例如,直接的物理接触不利于无菌操作。 又例如,要监测一个密封容器内微生物的生长情况,这些方法就无法应用。而且 这些方法中有的方法的仪器费用比较高。菌落计数法和颜色改变单位法 ,在细菌检测方面也有应用,但这些方法不能跟踪监测细菌的 生长过程,而且菌落计数法不能用于检测支原体这种缺乏细胞壁的微生物。 无线磁弹性传感器的磁振片是由含铁、镍、钼、硼的非晶形合金制成的。传 感器在一个交变激发磁场中能产生一个特有的共振频率,传感器振动产生的磁通 量可通过检测线圈进行非接触式的检测,因此能够无线遥测传感器共振频率的变 化是磁弹性传感技术的一个有利特性。磁弹性传感器的共振频率除了与其自身的 物理结构有关外,还受到传感器上装载的物质及所处环境等因素的影响,从而可 用来进行多方面的检测。近年来,已有将无线磁弹性传感器用于测定压力、流速、 粘弹性、二氧化碳、氨等物理量书和葡萄糖‘、胰岛素【】、细菌【,、蛋白 质【引、凝血因子【】、抗原【、乳腺癌细胞【】等生物物质的研究报道,但有关应 用无线磁弹性传感技术实时、长时间和原位监测生殖支原体生长情况的研究还未 见其他文献报道。 本文应用无线磁弹性传感器对的正常生长情况进行了实时、长时间和原 位的监测,并评价了四环素和左氧氟沙星两种抗生素对生长的抑制效果。磁 弹性传感器由带状软磁合金条带切割而成,在表面涂一层聚亚胺酯膜,可以 保护 磁振片不被氧化并提供叠一个生长附着面。附着于传感器表面致使传感器共 振频率下降,从频移值与培养时间,的关系曲线可清楚的看出无线磁弹性传 感 器对生长过程的监测效果和对抗生素抑制作用的评价效果令人满意。 材料与方法 .材料 标准株..由南华大学病原微生物研究所提供;四环素、左氧氟沙星、 .培养基材料购于北京博大泰克生物基因技术有限公司,一培养基配置方 法按参考文献【】,其他所有化学试剂均是分析纯。 。.培养液配置方法,配制 .培养液分别取: 牛心消化液 ; 胰蛋白胨 ; 蛋白胨 ; 葡萄糖 滤膜过滤; . .%酚红溶液 ; 。 %酵母浸液 用将培养液值调至.~.后高压灭菌,冷却至?时加入 最终培养液值为..。 为软磁合金条带,合金成分为 ,购于美国公司。传感器由铁合金磁条 带切割为岬的矩形磁振片。传感器分别用纯水和丙酮超声清 洗,用氮气吹干。为保护磁振片不被氧化腐蚀并提供一个微生物生长附着面, 在 传感器两面均涂上一层聚亚胺酯膜 ,曲,, 待室温下干燥后将传感器放入 环境下固化小时,使聚亚胺酯膜变得坚实, 高压灭菌后备用。 .方法 把包被聚亚胺酯膜的传感器放入装有 一培养基的小试管内。再把小 试管插入一个小线圈内,线圈与频率检测系统连接用于信号遥测【】,装置示 意图 后把小试管插入线圈,将小试管和线圈一起放 见图。在小试管内接种 .培养箱。,%培养。培养分两组,分别是正常培养组和抗生素 抑制组。在培养过程中用检测系统连续监测并记录传感器的共振频率随时间 的变 化情况。 结果与讨论 .操作原理 图.为无线磁弹性传感器的操作原理示意图。在外加交变磁场的激发下, 磁振片产生一定频率的纵向磁致伸缩振动。磁振片振动产生的交变磁通信号用一 个接收线圈和频率检测系统无线检测,频率检测系统与计算机相连接,检测出的 传感器的频率和振幅由计算机记录并显示。传感器与检测系统之间没有任何物理 连接。当外加交变磁场的频率发生变化时,传感器的振动频率和振幅亦随之发生 变化。当外加交变磁场的频率等于传感器的机械固有频率时,磁振片发生共振的 振幅达到极大值。磁振片固有的共振频率而可以用公式表示如下: . 厂。上 一叵 式?是杨氏模量,是泊松比,是传感材料密度,三是传感器长度。 当有质量为的物质沉积或粘附到质量为的传感器的表面上时,传感器的共振 频率将从而变化至够其变化值?何由式.给出【】 . :?:一粤 式中掣是传感器响应的频移值,矗是传感器的初始共振频率,是传感器的 质量,是传感器质量的改变量。式表明随着附在传感器表面的目标分析 物的增加,传感器的质量将增加,传感器的频移值将相应地线性下降,从而可 对 目标分析物进行定量检测。 图.实验装置示意图. . . . . / 图.磁弹性传感器频率响应曲线 .培养 :培养 图.为培养液中传感器的振幅随频率的变化曲线图。曲线为培养开 始时传感器的响应曲线,曲线是培养小时后传感器的响应曲线。振幅达极 大值时对应的频率即为传感器的共振频率。从图中可以看出,与培养开始时 相比 较,培养小时后传感器的共振频率显著降低。这表示随着培养的进行,培养 液中的数量越来越多,附着在传感器表面的也就越来越多,于是传感器 共振频率降低。即附着在传感器表面的靶物质质量的增加和传感器共振频率 的下 降是相对应的。 .传感器的响应与生长曲线 在不接种的情况下,先将传感器置入培养液内,放.培养箱 ,%内放置一段时间作空白对照实验,检测可能存在的非特异性吸附。 在这期间,传感器的共振频率维持在. 恒定不变,结果表明不存在非特 菌株进行密封培养, 异性吸附。实验组在培养液中加入某一浓度的 在培养过程中连续不断的检测记录传感器共振频率的变化情况。 菌株正常培养情况下传感器频率的变化情况。在培养 图.表明在 过程的前小时共振频率随时间增长而缓慢减小,在培养~小时之间共振 频率减小的最为显著,小时之后共振频率随时间的减小又趋于缓慢。共振频 粘附在传感器表面上增殖导致传感器表面的负载质量增 率的减小是因为 加。在整个培养过程中共振频率的总降低值是 在 。?一曲线表明 正常培养情况下的生长曲线分为三个阶段:生长迟缓期,开始培养后小时; 对数生长期,培养~小时;稳定期,培养小时后进入稳定期。到达稳 停止增殖,数量 定期后意味着培养基中的营养成分几乎被消耗完,此时 基本保持不变。 ? 屹? ? 呜 了 ? 憎/苛 巧? 咱? 吖? 喝? 呻? / 图 正常培养生长曲线 . . 为验证 生长过程分为三个时期的结论,分别用高倍显微镜 一对培养、、、小时后的传感器表面进行成 能够粘附在 像。高倍显微镜成像结果见图?。从图中可以观察到 数量逐渐增多,与无线 传感器表面并生长繁殖。随着培养时间的延长, 传感器的检测结果一致。 图? 在一培养基中不同阶段显微镜 镜检图 . 用法对无线磁弹性传感器的检测结果进行了进一步的验证。 能够分解葡萄糖使培养液酸度增大,从而能使.培养液的颜色由红色变为橘 黄色,根据这一特点可以对生殖支原体的代谢活力进行检测。 法的操作过程:取只无菌试管,每一管装. 一培养液;在 加入第 第一管加入. 某一培养时期菌液,充分混匀,从中吸取. 二管,依次类推,倍梯度稀释,一直到最末一管;将所有试管放入培养 ,%培养小时,以培养液颜色改变的最末一管作为待测菌液的 箱,也就是支原体的最大代谢活力,比如第六管出现颜色改变,其相对浓度就 一。 是 约含.个细菌【。用法测定的结果与传感器检 ~.× 之间时 测的结果基本一致,结果显示当浓度在. 矽与有良好的线性关系,线性回归方程为一. ’ ~。法更进 一.,相关系数.,传感器的检出限是.× 一步的证明无线磁弹性传感器可以很好地应用于长时间的实时、原位监测 的生长情况。 .抗生素抑制效果的评价 本研究选择了四环素和左氧氟沙星两种抗生素,用于无线磁弹性传感器评价 抗生素抑制效果的实验。这两种药物的抑制机理不相同。四环素的抑菌机制 是通 过阻止氨酰基与核糖核蛋白体的结合,阻止肽链的增长及蛋白质的合成而抑 制细 菌生长,高浓度时有杀菌作用【】,左氧氟沙星的作用机制是抑制细菌旋转 酶细菌拓扑异构酶的活性,阻碍细菌复制从而抑制细菌的繁殖【】。 培养受四环素抑制的曲线如图.所示,受左氧氟沙星抑制的 曲线如图所示。与对照培养组图.相比较,加入抗生素后明显的抑制了 的增殖。在抗生素存在的情况下,的抑制生长曲线的迟缓期明显延长, 对数生长期的时间也变短,的增殖量明显减少,并且由衰退期取代了稳定期。 蚺 三一 奇一? ? / 的生长曲线 图不同浓度四环素存在下 . .肛/ .“/ . / ? 睛 一 苛一? 的生长曲线 图不同浓度左氧氟沙星存在下. /. .蝉. 图.为培育小时的情况下共振频率漂移值与抗生素浓度的关系曲线。 由图可以看出,抗生素浓度越大,共振频率下降得越少,表明抗生素的抑制能 力 随浓度而增加。 ? ?? 吨? 昌一 、、 ‘ 呻 司一 ?,啊司 一 ?. . 丫丑, /‖ 图.振频率漂移值与抗生素浓度的关系曲线 . 仔 左氧氟沙星 四环素 抗生素对生长繁殖的抑制效果在数值上可以用抑制率厄来描述。抗 生素抑制率 ,/可用公式表示如下: 皿:??×% . 瓴 ?而和另是正常培养和加入抗生素抑制培养时传感器共振频率的频移 值。匝值的大小与抗生素浓度和类型有关。实验表明,浓度为. /的四环 素对培养时的的抑制率是.%,而浓度为. /的四环素对培养相 同时间的的抑制率达到了.%。同样条件下,左氧氟沙星的抑制效果与四环 素有所不相同。实验数据表明浓度为. /的左氧氟沙星在培养时的抑 制率为.%,在相同培养时间下,浓度为. /的左氧氟沙星的抑制率则达 到了.%。达到%抑制率时所需抗生素的最低浓度可用? % 表示。由实验结果计算可得 出加入抗生素后培养时时四环素的为.,左氧氟沙星的 为. /。两种抗生素;的抑制效率不同,这是两种药物的抑制机 理不同所造成的。从两种药物的抑制生长曲线也可以看出两种药物的抑制机 理不 同,四环素作用于比较迅速,左氧氟沙星对的抑制作用相对较慢。但从长 期效果来看左氧氟沙星的抑制效果比四环素好。寸 ?.一』. .书?.卜 心. 寸剞.? 昏.。. .刊.?价 .』.心卜 .【 价.刊?.峪 ?.州.? 乱.一刊【. .寸州心.卜 心一 .州.寸 .尊.寸寸 譬,装?州磊 苫。量???。召墨哥暑暑。吾 岔 .刊?.屿价 卜.制卜.寸 .卅?.?卜 寸.州哆.寸 .刊. .州.卜心 . ; 摹。卜 善? ?岭 心.?. .刊.心 .心。:卜.夺卜 ?.州西. 卜.书. 卜.荆.岔岭 寸寸 一.州寸.价 .寸州?.叼 .寸尊.? .州一.? .州.心 .州.卜 息葛菪?基母装一× ’???????? ?.刊心.? .寸刊.价 ?.寸州.卜” .。疋.价 .干.心 岭.书.卜 口。召一勺若髓勺.?絮尸一 一 .南一召?.一?暑皇四 一奇。牙一 鼍装?州靼吝曙籁摹【× 口岔 寸.一州仓.寸 ..诮卜.卜 寸.寸州.? 价.卅.寸 ?.千“价 峪.州一. 心 摹瓣器暴窘。警莨垛酬蠕乙琳 冷芽一 可气?留。一召岛心口??衄皇。一一一.【皇 一口?海二、,勺爵 卜 心.?寺.寸 .州价.价 寸.州?.?卜 .刊.? 价.州寸.心寸 卜.书.卜 。?.?一 管料荽幂鼍 ?.州.寸 .。. 卜.州.? .书.寸 ”.刊卜. ?寸 .【尊. 宝 .【. . . 乜 “ 吣%它盘《勺?一禹口疆衄兽一二 。 口五譬扫卜 一譬戈。口? 专一?岛一焉。暑。磊冷寸趸崾司??趔龄爨料臻器餐迎鲁蝌雉懈刊堰证熏 懈划堰帐衣暴求奇霹崾町结论 的生长情况, 本文提出了用无线磁弹性传感器长期的实时监测原位 并成功评价了四环素和左氧氟沙星两种抗生素对的生长抑制效果。无线 磁弹性传感装置的传感器与检测系统无需任何物理连接,通过感应磁通量可以无 线遥测传感器信号,这一特点有利于实施无菌操作。无线磁弹性传感装置设备费 用低廉,基于蚋曲线无线磁弹性传感法可以推广应用于监测其他支原体的生长 过程及评价相关药物的抑制效果。第三章无线磁弹性免疫传感法定量测定生殖支原体 引言 ,是一种具有致病作用的支原体, 生殖支原体 在分类学上属于柔膜纲支原体目。鳓乏细胞壁,能独立复制【】,是一种介于细 菌和病毒之间的致病性微生物,能依赖其特殊的顶端结构黏附在人类泌尿生殖道 上皮细胞弓起尿道判。目前测定生殖支原体的方法主要有免疫荧光显微技术 【、免疫印迹法、探针技术口、聚合酶链反应【】技术等。其中 是一种新的基因诊断技术,灵敏度高、特异性强,但检测过程操作繁琐,用时较 长。因此研究更简便易行的测定生殖支原体的新方法具有一定意义。 磁弹性材料是一类含铁、镍、钼及硼等元素的非晶态合金材料。以磁弹性材 料为基础的传感器是近年发展起来的一种新型无线传感器。在外加交变磁场激发 下,磁弹性传感器可发生磁致伸缩振动,其振动产生的磁通可通过检测线圈进行 非接触式的检测,从而实现无线传感。磁弹性传感器的共振基频除了与其自身的 物理结构有关外,还受到传感器上装载的物质及所处环境等因素的影响,从而可 用来进行多方面的检测。近年来,已有将无线磁弹性传感器用于测定细菌【】、 肿瘤细胞【】等生物物质和压力、流速、粘弹性‘删、二氧化碳嗍及氨、葡萄糖 酬等物理量和化学物质的研究报道。但是将无线磁弹性传感器用于免疫测定 的研究则尚未见报道。 本研究用聚乙烯亚胺.戊二醛交联法将生殖支原体抗体固定在磁弹性传感器 表面上,根据通过抗原抗体特异性结合使粘附在传感器表面,传感器负载质 量增大可使传感器的共振频率发生变化的特点,建立了应用无线磁弹性免疫传 感法测定的新方法。用该方法对麟行定量检测,结果满意。 实验部分 .仪器与试剂 ..传感材料与装置 ,美国即,公司。将合金条切割为 蝉的 矩形磁弹性片用于制备传感器。无线磁弹性传感系统示意图见图.。图.无线 磁弹性传感系统示意图.? ..试剂与生物材料生殖支原体抗体;聚乙烯亚胺 ;戊二醛;牛血清 白蛋白京博大泰克生物基因技术有限公司;磷酸盐缓冲溶液;. 培养液。所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。 培养液的配置按文献【】方法。配列 .培养液分别取:牛心消 化液 ,胰蛋白胨 ,蛋白胨 ,葡萄糖 。岬滤膜过滤,.%酚 红溶液 ,%酵母浸液 ,用将值调至.~.后高压灭菌,冷 却至?时加入小牛血清 ,青霉素“,最终培养液值为 .~.。 堙标准株 由南华大学病原微生物研究所提供。用.培养液培养不同.实验方 法 ..磁弹性免疫传感器的制备 将传感器磁振片分别用丙酮、无水乙醇、双蒸水清洗,吹干。在预处理后的 后, 传感器表面滴加此 /聚乙烯亚胺甲醇溶液,室温放置 分别用无水乙醇、双蒸水清洗、吹干;滴 , 戊二醛溶液,?水浴 用双蒸水清洗;吹干后,滴:此. / .面抗体溶液,?水浴 。取出后分别用洗涤液、双蒸水清洗、吹干;最后用. / 溶液滴 至包被过的传感器表面,?水浴 ,以封闭传感器表面尚未反应的活性 基团。分别用洗涤液、双蒸水清洗,吹干。保存在?冰箱里,备用。 ..检测方法 把包被有生殖支原体抗体的磁弹性免疫传感器放入装有 不同浓度的魄 悬液的小试管内。把小试管插入一个小线圈内,线圈与频率检测系统连接用 于信 号遥测。将小试管和线圈连同一起放.培养箱。,%育。用检测 系统检测并记录温育 时传感器的共振频率。同时作空白对照试验。 结果与讨论 .频率响应曲线 包被了生殖支原体抗体的磁弹性免疫传感器的频率响应曲线见图.,图? 中曲线为传感器在不含的空白溶液中的频率响应曲线,曲线为传感器在 悬液中的频率响应曲线。曲线表明传感器发射信号的振幅随频率变化。最大 振幅 对应的频率即为传感器的共振频率。从图.中可以看出,在懈液中即结合有 的传感器共振频率明显低于空白液中的共振频率,据此可以对蚴行定量测 定。 如 图?传感器频率响应曲线 . 空白响应曲线 ;在螭液中的响应曲线 为了验证在尥悬液中是否通过抗体抗原特异性结合反应后粘附于 倍对温育 传感器表面,分别用高倍显微镜 后的空白液和悬液中的传感器表面进行成像。显微镜成像结果见图?。 能够通过抗原抗体特异性结合黏附在传感器表 从图.中可以观察到 面,与无线磁弹性传感器的检测结果一致。