功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼肌基质金属蛋白酶mrna的表达

功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼肌基质金属蛋白酶mrna的表达 功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼肌基质金属蛋白酶mRNA的表 达 功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼肌基质金属蛋白酶mRNA的表 达 【关键词】 咀嚼肌 摘要:目的 研究功能性矫治器引导大鼠下颌前 伸后咀嚼肌中基质金属蛋白酶(MMPs)mRNA的表达，探讨功能性颌骨 矫形过程中咀嚼肌适应性变化的生物学机制，为矫形治疗提供新的理 论依据。方法 分别采用RTPCR法、实时荧光定量PCR方法观察戴矫 治器(实验组)和不戴矫治器(对照组)3、7、14、21d大鼠二腹肌前腹 中MMP2、MMP9 mRNA表达和表达差异。结果 ?实验组和对照组大鼠 二腹肌前腹中MMP2、MMP9 mRNA均有表达。?MMP2mRNA、 MMP9 mRNA 表达差异:实验组3、21d后表达增加，其中21d较14、7d表达明显 增加;而对照组21d较14、3d表达明显增加。结论 ?MMP2、MMP9 在mRNA水平参与了咀嚼肌正常的生长发育过程;?功能性矫治器引 导大鼠下颌前伸后咀嚼肌中MMPs在mRNA水平参与了咀嚼肌的适应性 变化。 关键词:咀嚼肌;基质金属蛋白酶;mRNA;下颌前伸;RTPCR ABSTRACT: Objective To investigate molecular changes in growing rats masticatory muscle after functional mandibular protrusion. Methods SD rats were randomly divided into eight groups as control 3d, 7d,14d, 21d and experimental 3d,7d,14d,21d. The RTPCR and qPCR methods were used to find expression and any differences of mRNA of MMPs in growing rats masticatory muscle after functional mandibular protrusion. Results ? Expression of MMP2, MMP9 mRNA expressed in all growing rats masticatory muscle. ? Expression differences of MMP2 and MMP9 mRNA in 3d, 21d were found between control and experimental groups after functional mandibular protrusion. Conclusion ?MMP2 and MMP9 mRNA participate in masticatory muscle normal development. ? MMPs mRNA involve changes in growing rats masticatory muscle after functional mandibular protrusion. KEY WORDS:masticatory muscle; MMPs; mRNA; mandibular protrusion; RTPCR 下颌骨的功能性矫形治疗是在生 长发育期通过刺激患者的下颌骨生长达到矫治下颌骨发育不足畸形 目的。在引导下颌前伸的过程中，除了骨组织在肌张力的作用下发生改建和生长外，咀嚼肌也会发生相应的变化和改建，以保持和稳定下颌骨生长的结果。近些年来，功能性矫治器的研究多集中在下颌骨的改建和生长上，特别是髁状突的适应性改建及其影响因素，而对咀嚼肌功能的适应性变化研究较少，对咀嚼肌适应性改变的生物学机制尚不清楚。 本研究通过功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼 肌中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)mRNA的表 达和表达差异，探讨功能性颌骨矫形过程中咀嚼肌适应性变化的生物学机制，为矫形治疗提供新的理论依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 选用健康的雄性SD大鼠40只，4周龄，体质量(70土5)g。随机分为8组:不戴矫治器的对照3、7、14、21d组，戴矫 治器的实验3、7、14、 21d组，每组5只。自由饮水，定时摄食。 1.2 主要试剂 RNA提取试剂(Trizol)、反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit):MBI Fermentas公司; PCRMasterMix:北京天为时代科技有限公司;DyNamo SYBR Green qPCR Kit(Finnezyme):东盛创新生物公司赠。 1.3 矫治器的设计 参 照Petrovic[1]使用的矫治器并加以改良。矫治器由塑料底板、斜面 导板和口外固位臂三部分组成。斜面导板为6mm×8mm的带环片，斜面导板与上颌咬合平面成20?-25?，矫治器戴于大鼠上切牙。当大鼠闭口进行功能运动时，下切牙咬在斜面导板上，下颌被引导前伸。 1.4 标本制备 分别于戴矫治器3，7，14，21d后断颈处死。取实验 组和对照组大鼠二腹肌前腹置于有RNALater液的DEPC处理的EP管 中，迅速置于液氮罐中，于每次标本收集结束时移于-80?冰箱保存。 1.5 二步法RTPCR 提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链，分别按说 明书进行。引物设计合成:MMP2上游引物:5’CTA TTC TGT CAG CAC TTT GG3′，下游引物:5′CAG ACT TTG GTT CTC CAA CTT3′，产物 长度310bp;MMP9上游引物:5′TTG GCT TCC TCC GTG ATT3′，下游引物:5′TGT ATG GTC GTG GCT CAT A3′，产物长度293bp;β actin 上游引物:5′TCC TTC CTG GGT ATG GAA TC3′，下游引物:5′ACT CAT CGT ACT CCT GCT TG3′，产物长度300bp。PCR DNA扩增按说明 书进行。MMP2扩增反应条件为:95?预变性5min，95?变性30s， 55?退火30s，72?延伸2min，共35个循环，最后72?再延伸7min。 MMP9扩增反应条件为:MMP9的退火温度为60?，其余条件同MMP2。 1.6 实时荧光定量PCR 提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链同上。 在进行DNA扩增时按DyNamo SYBR Green qPCR Kit说明书进行。MMP9， MMP2反应条件除反应为40个循环外，其余同PCR DNA扩增。 2 结 果 2.1 MMP2、MMP9 mRNA的表达 RTPCR产物经20g/L琼脂糖凝胶 电泳鉴定，扩增片断特异性强，MMP2条带大小约310bp(图1)，MMP9 条带大小约293bp(图2)，βactin条带大小约300bp(图3)，均与预 期大小相符。MMP2，MMP9 mRNA在各实验组和对照组均有表达。 图 1 MMP2 RTPCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(略) Fig.1 MMP2 agarose gel electrophoresis results of RTPCR production 1,2,3,4,5,6,7,8, represent 21dT, 21dC, 7dC, 7dT, 14dC, 14dT, 3dC, 3dT, respectively. T: test group; C: control group 图 2 MMP9 RTPCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(略) Fig.2 MMP9 agarose gel electrophoresis results of RTPCR production 1,2,3,4,5,6,7,8, represent 21dT, 21dC, 7dC,7dT,14dC,14dT,3dC, 3dT, respectively. M: marker 图3 βactin RTPCR 扩增产物 琼脂糖凝胶电泳结果(略) Fig.3 βactin agarose gel electrophoresis results of RTPCR production 1,2,3,4,5,6,7,8, represent 21dT, 21dC, 7dC, 7dT,14dC,14dT, 3dC, 3dT, respectively 2.2 MMP2、MMP9 mRNA的表达差异