白带中白色念珠菌致病性的研究_cropped

白带中白色念珠菌致病性的研究_cropped 【论 著】() 文章编号 :10052376X20040520284203 白带中白色念珠菌致病性的研究 黄长武 ,李兴禄 ,邱君凤 ()重庆医科大学第二临床学院 检验科 ,重庆 400010 () 【摘要】 目的 探讨女性生殖道分泌物 白带中白色念珠菌的致病性 ,评价其在白带中分离的临床意义 。方 法 对重庆医科大学第二临床学院 2002 年 1 月,2003 年 12 月 300 株白带分离的白色念珠菌进行蛋白酶测定 ,并 从蛋白酶活力高 、中 、低中分别选 2 株作血管内皮细胞毒力和粘附性测定 。结果 300 株白色念珠菌全部检出蛋白 酶 ,其中蛋白酶活力高为 249 株 ,占 8310 % ;中等活力 38 株 ,占 1217 % ;低等活力 13 株 ,占 413 % 。细胞毒力试验表 ( ) 明蛋白酶活力高 ,细胞毒性强 ,蛋白酶活力与毒力呈正相关 r = 019946 、P < 0101; 细胞粘附试验表明蛋白酶活力 ( ) 高 ,粘附能力强 ,蛋白酶活力与粘附呈正相关 r = 019944 、P < 0101。结论 蛋白酶是白色念珠菌重要的毒力因子 , 蛋白酶活力可直接反映其毒力 ,蛋白酶活力与其粘附直接相关 。白带中白色念珠菌具有致病性 ,临床应对其引起 的感染密切关注 。 【关键词】 白带 ;念珠菌 ,白色 ;致病性 【中图分类号】R37914 【文献标识码】A Study f or pathogenicity of Ca ndida albica ns in leucorrhea specimen HUANG Chang2wu ,L I Xing2lu ,QIU J un2feng ( Department of L aboratory , the Second College of Clinical Medicine & the Second Hospital of Chongqing Medical University , )Chongqing 400010 , China 【Abstract】 Objective To understand pathogenicity and clinical significance in leucorrhea specimen. Methods Acid proteinase of the 300 Candida albicans strains were detected on milk2agar plate from 2002. 1 to 2003. 12. According to different ( ) level of acid proteinase activityhigh ,middle ,low,6 strains were selected to determine the cytotoxicity and adhesiveness by blood vessel endothelial cells. Results All of 300 strains could be detected proteinase . There were 249 strains high2proteinase2activity , accouting for 8310 % ,38 strains middle2proteinase2activity ,accouting for 1217 % ,and 13 strains low2proteinase2activity ,accouting for 413 %. Cytotoxicity and adhesiveness tests showed that they were associated with a directly positive correlation between them ( ) and proteinase2activity r = 019946 、P < 0101 ; r = 019944 、P < 01011Conclusion These results indicated that acid proteinase was a putative virulence factor for Candida albicans1Proteinase activity could be used as the direct parameter for virulence of Can2 dida albicans . There was a directly correlation between proteinase activity and adhesiveness. Candida albicans had pathogenicity and clinical significance in leucorrhea specimen. 【 Key words】 Leucorrhea ; Cahdida albicans ; Pathogeniciy 白色念珠菌是人体正常菌群之一 ,它主要寄生, 为 此 , 笔 者 对 重 庆 医 科 大 学 第 二 临 床 学 院菌丝 于人体的体表及口腔咽喉等部位 。随着临床抗生素 2002 年 1 月,2003 年 12 月 300 株白带标本分离的 及抗癌药物的大量应用 ,白色念珠菌已成为最重要 白色念珠菌致病因子进行了探讨 ,以期阐明白带中 1 的医院感染病原体之一。同时也是引起女性生殖 道白色念珠菌检出的临床意义 。 感染的常见菌 。白 色 念 珠 菌 存 在 芽 胞 型 和 菌 丝 型 ,1 材料与方法 2 111 材料其菌丝增多表明从腐物寄生菌转变为致病菌。 11111 菌 株该 院 检 验 科 保 存 的 2002 年 1 月白色念珠菌的致病因子主要有白色念珠菌酸性蛋白 ( ) DME/ FIZ 培养液行原代培养 ,将传至 2,3 代内皮细酶 Candida albicans acid proteinase , CAP、粘附性 、疏 3 胞消化后 ,制成悬浮细胞 ,台盼蓝染色计数 ,活细胞 水性 、芽管生成以及荚膜, 其中 CAP 在白色念珠 4 数 > 95 % ,备用 。 菌引起的疾病中起了重要作用。诊断其女性生殖 112 方法道感染以白带中发现胞子及菌丝 ,常规很少发现 11211 用产酶培养基 37 ?增菌 24 h ,转种于哥伦 【收稿日期】2004202210 比亚血平板 37 ?培养 24 h ,用来恢复白色念珠菌的 () 【作者简介】黄长武 19642,男 ,副主任技师 ,从事临床微生物检验及产酶等生物学活性 ,保存于 4 ?冰箱备用 。 5() 11212 白色念珠菌蛋白酶活力 A测定 试验菌h 后 ,染色镜检观察 ,计数 200 个细胞中粘附有 3 个 YGM 牛奶平板上 ,37 ?培养 72 h 后 ,用游及以上真菌的细胞数 ,计算百分率 。株点种于 2 结果标卡尺测量菌落及其周围透明环的直径 ,以透明环 ( ) () ()直径或菌落直径 R来判断酶活力 A的大小 。 211 见表 1 。白色念珠菌蛋白酶活力 A 6()白色念珠菌蛋白酶活力 A 表 1 ()11213 白色念珠菌细胞毒 测 定 四 唑 盐 MTT ( )比色试验 。将传代血管内皮细胞用胰酶消化 ,配成 透明环直径/ 菌落直径 R 白色念珠菌 6R < 210 210 ?R < 310 R ?310 10/ ml 的细胞悬液 ,将高中低共 16 株白色念珠菌配 8株数13 38 249 成 10/ ml 的菌悬液 。细胞悬液和真菌悬液各加 100 ( )百分比 %413 1217 8310 μl 于 96 孔培养板 ,使细胞?细菌为 1?100 ,同时作细 300 株 白 色 念 珠 菌 在 其 菌 落 周 围 均 出 现 透 明 胞及真菌对照 ,37 ?、5 % CO孵育 24 h 后 。每孔加 2 ( ) 环 ,透明环直 径/ 菌 落 直 径 R范 围 是 1161 , 6129 ,μ入 5 mg/ ml MTT 20l ,继续孵育 4 h ,终止培养 。分 ( ) 按两者比值大小将试验菌株分为高活力 R ?310μ别用无菌滤纸吸干每孔液体 ,每孔再加入 150 l 二 () 249 株 ,占 8310 % ;中等活力 210 ?R < 31038 株 ,占( ) 甲亚砜 DMSO, 振 荡 10 min , 使 结 晶 物 完 全 溶 解 。 ( ) 1217 % ;低等活力 R < 21013 株 ,占 413 % ,共 3 组 。在 490 nm 下用酶联免疫比色计比色 ,测定每孔吸光 212 色念珠菌毒力测定 见表 2 。经统计分析 ,细 度值 。 ( ) 胞对照吸光度2x2自身对照吸光度与蛋白酶 活 力 71214 白色念珠菌粘附性测定 将上述 6 株白1 γ之间呈正相关 ,= 019946 , P < 0101 。 7色念珠菌胞子分别用 Hank’s 液配成 2 ×10/ ml 的菌 213 白色念珠菌孢子的粘附性 见表 3 。经统计5 悬液 ,传代内皮细胞配成 10/ ml ,以 200?1 的比例等 分析 ,粘附百分率与蛋白酶活力之间呈正相关 , r =() ?、5 % CO孵育 24体积 1 ml混合内皮细胞 ,于 37 2 019944 , P < 0101 。 表 2 白色念珠菌毒力测定结果 C41 C137 C5 C23 C221 C122 菌株 ( )1373 143 158 1695 1837 1838 000000平均吸光度值 X ( )01577 01525 01455 01335 01258 01242 细胞对照吸光度2X2自身对照吸光度 ()蛋白酶活力 A 6127 5171 412 3105 1163 1162 表 3 白色念珠菌孢子的粘附性 C41 C137 C5 C23 C221 C122 菌株 ( )1645 162 1425 1335 1215 1165 000000粘附百分率 % ()6127 5171 4120 3105 1163 1162 蛋白酶活力 A 5 3 讨论王彤敏等 Kwon2chung 等在小鼠毒力试验中 , 发现 、 311 白色念珠菌的致病因子它包括 CAP 、荚膜及 了小鼠死亡率与菌株产蛋白酶水平成正比 。Shimizu 粘附性 、芽管生成和疏水性等 。菌体表面的疏水性是 等用鸡胚绒毛尿囊膜进行感染试验也证明产酶能力 ,是构成白色念珠菌粘 白色念珠菌很重要的毒性因子 高的菌株侵袭力也越强 。它与该菌侵袭和破坏组织 附到宿主表面的第一步 ,在白色念珠菌的侵袭开始和 有直接 关 系 。Ollert 等 研 究 表 明 此 酶 还 能 分 解 角 蛋 11 传播中起着重要的作用 ,疏水性白色念珠菌较亲水性 白 、胶原蛋白。 白色念珠菌产生芽管的速度快 ,其粘附组织 、塑料 、导 CAP 的 检 测 方312 白色念珠菌 CAP 的 分 泌 情 况 8 管和人造瓣膜的能力强。目前在粘附性的研究中法有多种 ,简便 、易行的平板检测法 ,如 BSA 平板法 、 12 认为白色念珠菌的粘附性主要与胞壁的甘露糖和甘 酪蛋白平板法及牛奶平板法等 ,牛奶平板检测法 9 8露糖2蛋白酶复合物及几丁质等有关 。Tronhin 等 具有简单 灵敏 、且不需染色可 直 接 观 察 结 果 等 优 发现芽管生成能增强其粘附上皮细胞 ,并能阻止中性 点 。该实验采用 YGM 牛奶平板法 ,检测 300 株从白 粒细胞对其吞噬作用 。李秀辉等注意到白色念珠菌 带标本分离出来的白色念珠菌 ,结果见表 1 , 其产酶 3 可能具有荚膜结构 ,能增强白色念珠菌的侵袭力。 率达 到 100 % , 且 高 活 力 达 83 % , 而 低 活 力 仅 仅 为 12 5 王鲁等研究证明抑制白色念珠菌对黏膜上皮细胞 、血 413 % ,中度活力占 1217 % ,与国外及国内报道 10 管内皮细胞的粘附 ,可降低它的侵袭力。白色念 一致 。Ruchel 等采用平板法检测数种念珠菌的产酶 ( ) 珠菌分泌的胞外酶 CAP是其主要的毒性因子之一 , 情况 ,发现蛋白酶的检出率由高到低依次为白色念珠 1 Jarvis WR. Epidemiology of nosocomial fungal infection with wmphasis on 菌 、热带念珠菌和近平滑念珠菌 ,与它们的致病力强 () candida speciesJ 1Clin Infect Dis ,1995 ,20 6:1526215301 13 弱顺序一致。2 陈世平主编 1 真菌感染学 M 1 沈阳 : 辽宁科学技术出版社出版 , 313 白色念珠菌细胞毒力试验 该实验采用血管内 皮200011491 ( 细胞作为实验对象 ,以活细胞还原 MTT 的能力 吸 光3 李绣辉 ,马廉兰 ,曾祥风 1 白色念珠菌可能具有荚膜结构 J 1 中华 ) () 度值来判断蛋白酶活力与致病力的关系 。由表 2 微生物和免疫学杂志 ,2000 ,20 3:20222031 Kondoh Y ,Shimizu K ,Tanaka K1Proteinase production and pathogenicity of 4 ( 显示 :白色念珠菌蛋白酶活力与细胞死亡呈正相关 r Candida albicans. II1Virulence for mice of C1 albicans strains of different ) = 019946 , P < 0101,与文献报道的小鼠毒力试验结() proteinase activity J 1Microbiol Immunol ,1987 ,31 11,1045210601 王彤5 ,8一致 。表明白色念珠菌的 CAP 与上皮细胞损果 5 敏 ,韩景田 ,董小青 ,等 1 白色念珠菌蛋白酶与其毒力关系的 研究伤呈正相关 。从试验结果可以看出 ,用体外传代细胞 () J 1 中国微生态学杂志 ,2000 ,12 4:21522201 作为实验对象 ,敏感性较高 ,结果可靠 ,试验时间短 。 司徒镇强 ,吴军正主编 1 细培养 M 1 西安 : 世界图出版西安公 6 司 ,1996118621871 由表 1 可知白色念珠菌全部能产 CAP ,可见 CAP 是白 7 郭宁如 ,吕桂霞 ,吴绍熙 1 念珠菌体外粘附上皮细胞的观察 J 1 中 色念珠菌重要的毒力因子 ,细胞毒性在致病的过程中 () 国医学科学院学报 11994 ,16 4:31223151 起着关键的作用 。陈敏 1 白色念珠菌的致病性 J 1 国外医学微生物学分册 ,1991 ,14 8 粘附性包括胞子及314 白色念珠菌的粘附性试验 () 3:12321251 芽管两相的粘附 ,对此均有报道 ,表明芽管粘附大于 侯幼红 1 白色念珠菌粘附的研究进展 J 1 国外医学微生物学分 9 7 () 册 ,1994 ,17 1:232251 胞子的粘附。该文讨论了 CAP 与粘附性的关系 , 10 王鲁 ,黎斌 ,刘荣卿 , 等 11B5 单抗抑制白色念珠菌对上皮细胞 1用于阐明 CAP 是否参与菌体粘附 , 结果显示粘附率 () 内皮细胞的粘附J 1 重庆医学 ,2002 ,31 1:222231( ) 与 CAP 活力成正相关 r = 019944 , P < 0101。有 报 Ollert MW , Wende C , Gorlich M , et al1Increased expression of Candida 11 道用白色念珠菌感染小鼠皮肤 ,发现感染的严重程度 albicans secretory proteinase , a putative virulence factor , in isolates from 9 与 CAP 分泌密切相关。说明 CAP 参与了白色念珠 human immunodeficiency virus2positive patients J 1J Clin Microbiol , 菌的粘附侵袭作用 。这与该实验结果相一致 。 通过1995 ,33 :2543225491 12 Ray TL1 Payne CD1Comparative production and Rapid Purification of Ca2 对白带标本中白色念珠菌致病因子的分析 , dida Acid Proteinase from Protein2Supplemented CulturesJ 1Infection and 说明了在白带标本中真菌分离培养的重要性 ,因此在 () Immunity ,1990 ,58 2:50825141 ( ) 白带标本中分离到真菌 尤其是白色念珠菌应该引 13 Ruchel R ,Tegeler R ,Trost M. A comparison of secretory of proteinase from 起临床重视 。 different strains of candida albicansJ 1J Med Vet Mycol ,1982 ,20 : 2332 2441 【参考文献】 () 上接第 283 页常见革兰阴性杆菌对氨苄西林普遍耐 ,因此 ,经验用药也要小心 ,并密切胞菌对其天然耐药 药 ,大肠埃希菌对第 3 代头孢菌素的敏感性在 65 % 注意细菌室回报结果 ,及时加以调整 。 综上所述 ,鉴于儿科临床细菌谱与药物敏感性的 左右 ,而铜绿假单胞菌对哌拉西林或三唑巴坦 、头孢 不断变异 ,儿科医生与检验师必需经常和定期地分析 他啶较敏感 ;肺炎克雷伯菌对第 3 代头孢菌素的耐药 该地区 、该院常见感染菌株药敏特征的适时变化 ,才 率较高 ;沙门菌和变形杆菌的耐药率较低 。氨基糖甙 能不断提高感染治疗的临床水平 ,为众多患儿提供优 类和喹喏酮类抗菌药物对小儿的毒副作用大 ,其应用 质的服务 。 受到限制 ,与李家泰报道大肠埃希菌对喹喏酮类耐药 3 率达 50 %以上有所不同, 笔者发现大肠埃希菌对 左氧沙星和环丙沙星的耐药率分别为 29 %和 38 % 。 【参考文献】 1 徐亚萍 ,邵洁 1 浙江省儿童医院 1991,2000 年儿童败血症病原菌 对亚胺培南对革兰阴性杆菌保持非常高的敏感 () 变迁及耐药分析J 1 中华医学杂志 ,2002 ,82 1494529481性 ,它对这些菌产生的 ESBL 都高度稳定 。其敏感性 2 汪复 ,朱德妹 ,胡付品 ,等 1 上海地区细菌耐药性监测分析 J 1 中 除对铜绿假单胞菌和不动杆菌在 79 %和 94 %外 ,对 国医学杂志 ,2001 ,81 :172191 大肠埃希菌 、肺炎克雷伯菌均在 99 %以上 , 因此 , 亚 3 李家泰 ,Allan J W ,杨敏 1 中国细菌耐药监测研究 J 1 中华医学杂 胺培南是重症患者经验用药的最佳选择之一 。但由 志 ,2001 ,81 :12151 于它在铜绿假单胞菌中敏感性下降 ,而嗜麦芽窄食单