【doc】补肾中药醇提活性部位预防卵巢摘除小鼠的骨丢失

【doc】补肾中药醇提活性部位预防卵巢摘除小鼠的骨丢失 补肾中药醇提活性部位预防卵巢摘除小鼠 的骨丢失 中国骨质蕊橙杂志?02年2月第8卷第l期cKnJo皇’舳p?,.撇.vd8,?.1 补肾中药醇提活性部位预防卵巢 摘除小鼠的骨丢失 陈亚琼杨海燕黄艳缸辛晓燕吴曙光 ? 药物研究? t?要1目的研究补肾中药醇提话性部位(as-mgcH)对卵巢切除小鼠骨丢失的预防作用. 方法2月龄雌性昆明小鼠6o只随机分为6组并进行相应的处理:假手术组和去卵巢组用溶剂灌 胃.去卵巢+A~RKCH低,中,高剂量组分别按100吣,200mg,4OOmg?d’.给药,去卵巢+雌二醇组用 l7B-雌二醇10Fg?d给药实验4周后,观察股骨的骨密度和骨生物力学性能及血的骨生化指标的 变化.站累A~RKCH处理4周后,低,中l高3个剂量组与去卵巢组相比,使股骨总骨密度分别增 加了50%,47.2%,433%(P<0.05),A~RKCH中剂量组的结构力学性能有显着提高(P<0.o5),中 剂量组和高剂量组的最大载荷,最大挠度增加(P<0.05);AS-RKCH阻止了园卵巢切除导致的血清 碱性磷酸醇和骨钙紊水平升高(P<0o5).绪论As_1LKCH具有预防 卵巢切除诱导的骨丢失作用. 【美?词】补肾中药;小鼠卵巢摘除;骨密度;碱性磷酸酶;骨钙素 Activesitefromkidney-eeinforel~ChiherblflMpreventsbonel惜蜘mi耽 dmI.e CHENYaqiong,MGHaiyan,HUANGYanhong,a1.呐.咖呲ofObswtri~垃 白盯,埘Hospital, FourthMiiitarrMedicalUniters.Xi’an710032.ira 【A1,瞳州】ObjectiveTcsmdyactivesitehomki由一ir曲 rcChineseherbs(As_P,Kcu)?ap- venfiveremedyagainstbonel峭 Binm-a~iectemizedmiceMethodsFemaleKunminmice(:60.2months old)w蛳 eithersham—operated(8,n=to)orovariectomized(0VX,=50).OVxmicewere randomlyas一 8i印 edto5grOU~,of10e~h:OVX+(17Pesuadiol10g’d),andtheothergroupswerev朗As.RKcHat thedose0f100,2OO.4O0Illg’doralgavase~for4weeks,respectively.esham +VandtheOVX+V gvaupsreceivedvehicle,Kttheendofthestudy,吐噼b0噼 miaeraldenslty(BMD)oftheleftfem吡,theb0r虻hEc— mechanicsoftherhtmlli,ands帆I【? alkalinephosphate(ALP)and0e0ceinwemeasured.R拦IIIt岛1’ totalBMDofleftfemurw丑 sincin3AS-RKCHgroups(+5O%.+47.2%and43.3%respectlvelvvs. OVXgrouptP<0.05).structuralbehaviorofbonewasincreasedinOVX+E!groupandAS-RKCH2O0rag groap(vs.OVXgroup,P(0.05).ThepeakloadandthepeakdeflectionmincreasedinAS-RKCH2OOrag and4OO.llggroups(vsOVXgroup,P<0o5)ALPandosteocalcinweresignificantlydecreasedin AS-RKCHgroups(vB.OVXgroup,respectively.P<O05).ComtmimaAS?RKCHmayp~vembonelossin OVXmice. 【KeywordslChineseherbalmedicine;Kidney-reinforcing;Mice,ovariectomized;Boneloss: Alkalinephosp~rate;Osteocalcin 绝经后骨质疏松是一种随绝经年龄增长,卵巢 功能衰竭,而出现的全身骨量减少.病理性骨折发生 危险性增高的代谢性骨病,属于原发性骨质疏松. 随着人口老龄化,骨质疏橙逐渐成为危害老年妇女 健康的主要疾病之一.雌激素替代治疗是防治绝经 后骨质疏松的有效手段,但长期使用雌激素可使患 乳腺癌,子宫内膜癌危险性增高.因而寻找有效,副 基金]夏目:陕西省99自然科学基金资助项目 作者单位:710032西安,第四军医大学西京医院妇产科(阵亚 璩,黄艳红,辛晓燕);武警总n医窿妇产科(扬悔燕);第一军医大学 西京医院妇产科(吴曙光) 作用少的治疗方法及药物具有重要的意义.长期临 床实践及研究中发现一些具有补肾作用的中药在防 治绝经后骨质疏橙方面具有良好的作用,而副作用 较少的优点.中医认为绝经后骨质疏松与”肾虚”有 密切关系,通过补肾可使骨质疏松症状缓解,骨折发 生减少,但其机理如何,值得深入研究.本实验观察 了补肾中药醇提活性部位(As.RKcH)对卵巢摘除小 鼠骨密度,骨代谢指标和骨生物力学性能的变化.为 中药防治绝经后骨质疏橙提供实验依据. 中国骨质琉松杂志20O2年2月第8卷第1期ChinJom?pDl1l1eb 堕lv81旦 材料和方法 1.实验药品,试剂及仪器:AS—RKCH是将补肾 中药复方(主要由刺五加,熟地,淫羊藿等组成)经乙 醇萃取,50%溶解离心,取上清液得到含有活性部位 (AS—RKCH)的浸膏,实验前用溶剂(2%乙醇+98% 生理盐水)配制成相当于所需含生药浓度.其他试 剂和试剂盒有17B一雌二醇(Sigr,m),血清总胆固醇试 剂盒和血清碱性磷酸酶试剂盒(台湾标佳公司),血 清骨钙素放免试剂盒(北京原子能研究院同位素研 究所).实验仪器主要有双能x线骨密度仪(Ltmar 公司),1195万能压力测试机(Instron公司),12753’ 计效仪(LKB公司). 2.动物饲养条件与处理:雌性昆明小鼠购于本 校实验动物中心,饲养温度22?,12h光照,12h黑 暗,容许自由饮水及摄食.成年雌性昆明小鼠60 只,出生后60d,质量(37?2)g,随机分为6组,每组 l0只,适应性饲养5d后开始实验. 3.卵巢摘除模型复制:动物以1%戊巴比妥钠 (0.1g,kg)经腹腔麻醉后,取背部下方横行切口,剪 除长毛,切开皮肤1cm,分别在脊柱两侧切开背肌1 CI11,切1:3视野中可见一乳白色脂肪团,用小镊子将 脂肪团拉出切1:3外,分离脂肪团,见到粉红色卵巢, 摘除卵巢,同法摘除另一侧的卵巢,缝合伤1:3.假手 术组小鼠仅去除卵巢周围少量脂肪组织.术后第3 天开始阴道细胞涂片,如连续4d出现阴道上皮角 化细胞证明造模成功.术后第8天开始药物灌胃. 4.给药剂量及方法:所有药物均用溶剂(2%乙 醇+98%生理盐水)配制为所需的浓度,每只小鼠灌 胃0.5,每日一次,连续给药28d.AS-RKCtt按成 人的每It用药量(0.25g?L),换算成每日每只小 鼠用药剂量并分组如下:卵巢摘除+溶剂(OVX+v, 0.5m1),假手术+溶剂(Sham+v,0.5nd),卵巢摘除+ 雌二醇(OVX+E,10g),卵巢摘除+活性部位1组 (OVx+AS—L.1o0nag),O’Vx+AS—M(2oorag),O’Vx +AS—r[(4oorag).全部动物在最后一次喂药(第 28天)后24h,处死并采集以下标本进行测定分 析. 5.骨密度(bonemineraldensity,BMD)测定.:左 股骨取出后立即置人生理盐水,4?保存(不超过24 h),测定时取出,在双能x线骨密度仪(I~EXA)上测 定左股骨骨密度.分析数据时,将左股骨均分为3 个部分:股骨近段(p舶xima1),股骨中段(middle),股 骨远段(dista1),分别测定肢骨3个部分及总骨密度. 6.骨生物力学测试:动物处死后取出右侧股 骨,用生理盐水纱布包裹后置入一加?保存,测定时 取出放人生理盐水中,室温(20?)下浸泡复温3—4 h,采用3点弯曲试验方法.应用INSTRON-1195型 万能材料试验机进行测试.置右侧股骨于距为l0 him的支架上,以1ram/rain的速度下压股骨中段,记 录载荷一变形曲线,并测量肢骨中段的内外径. 7.血清分析:小鼠摘除眼球取血1—1.5ml,血 标本置4?冰箱内冷藏静置24h后经15000rpm离 心15min,分离血清.血清碱性磷酸酶(ALP)测定使 用对硝基苯磷酸盐法,血清骨钙素(oc)水平测定采 用放免分析法. 8.统计学方法:全部效据用llllealrl?SEI~I示, 使用SPSS8.0统计软件,t检验比较各组问的差异. 结果 1.对骨密度的影响 OVX+AS—L,OVX+AS—M及OVX+AS—H组 小鼠去卵巢后4周股骨总骨密度增加(见图1),分别 为+5O%,+47.2%及43.3%(v日.Sham+v.P< 0.05),与E2作用一致(+60%).卵巢摘除后,左倒 股骨近段,中段及远段3个部分的骨密度显着下降, 分别下降28.67%,33.6%和.3%(Y8.Sham+v, P<0.05).与OVX+v比较,AS—RTCH的低,中,高 3个剂量组增加左侧股骨近段的骨密度值分别为+ 101.04%,+61.02%及+111.,(P<0.05);OVX +AS一1组使股骨中段的骨密度增加45.86%(P< 0.05),而OYX+AS—L及OYX+AS—H组无明显变 化(P>0.05);O’qX+AS—L和OVX+AS—M组可使 股骨远段骨密度分别增加船.96%和+ 27.86%(P<0.05),而OVX十AS—H组无统计学意 义(P>0.05). 2.对骨生物力学指标的影响 各组小鼠右侧股骨3点弯曲实验骨的结构力学 和材料力学测试指标结果见表1.在加载速度为1 finn/rain的条件下,OVX小鼠右侧股骨的最大载荷 (ultimateload,tJ1.),弹性载荷(elasticload,EL),最大 挠度(ultimatedeformation,tJl~)和弹性挠度(elasticde— formation,ED)均比Sham+v组明显降低(P<O.05). AS—RKCH的3个剂量处理组中,OVX+AS一1组 的骨的结构力学性能有显着改善(P<005).OVX+ AS—M组和OVX+As—H组的最大载荷,量大挠度 骨质酶拙杂志20O2年2月巷第1期!堕!里:垫!!: 增加(P<0.05).E2可显着增强骨的结构力学性能 (P<0.03). 3.对骨转换指标的影响(表2) 对血清ALP的影响:小鼠去卵巢后4周血清 ALP水平显着升高(+26.B9%)(V8.Sham+V,P< 0.05).OVX+AS—L,OVX+AS—M及OVX+AS—H 组均显着降低血清ALP水平,分别下降22%,14%, 8%:OVX+As—M组的A【JP水平显着高于Sham+V 组,低于OVX+v组.对血清Oc的影响;小鼠去卵 巢后4周血清OC水平显着升高(+74.39%)(vB. Sham+V,P<0.05),同样OVX+As—L,OVX+As— M及OVX+AS—H组可分别使去卵巢小鼠血清oc 下降l7%,22%和27%(vs.OVX+V,P<0.05),但 这种下降幅度明显小于E2的作用,As各组与组 比较有显着性差异.OVX+As—M组的OC水平显 着高于Sham组,低于OVX+V组. 采1水 平的降低,而使骨代谢呈负平衡,骨吸收增强,骨重 董豳.自.囱.蜜.囱.囱.OVX+VSham+~AS—LAS-MAS+H阻 图1AS-RKCH不尉剂量对去卵巢小鼠左侧 股骨总BMD的影响 洼:与OYX+v组相比*P(O.05 逐步丧失,即破骨细胞性骨吸收增加,成骨细胞性骨 形成相对减弱,机体每完成一个骨再建周期将会损 失部分骨量,在若干周期后就形成了骨质疏松.中 医将绝经后骨质疏松的原因主要归结为肾虚.从现 代中西医结合的研究看,中医的”肾”涉及到内 分泌,神经,免疫,代谢等多种系统及功能,对全身的 生理功能起调节,整合作用,特别对人的生长发育, 鬟衍后代及衰老有重要调控作用.根据中医”肾主 骨”的理论,肾精不足,肾气虚衰是导致绝经后骨质 疏橙发生的重要原因.这一理论也与现代医学对骨 质疏松的认识一致,即骨质疏松不仅仅是骨代谢的 改变,而且是全身性改变,即内分泌,代谢系统的功 能衰退在骨骼系统中的反映.现代研究证实,肾虚 证是以下丘脑一垂体一多个靶腺系统功能紊乱,全身 生理机能减退为特征的一种机体反应状态.绝经后 骨质疏松当属肾虚范畴.近年来采用补肾法治疗绝 经后骨质疏松已取得显着疗效.补肾中药临床使用 效果与实验研究相似,与其他治疗药物相比,最独具 特色和显着优势表现为迅速改善软弱无力,腰膝酸 软等肾虚症状,许多患者在骨指标无明显改善时,临 床症状已消失,治疗的顺从性较好.目前认为,补肾 中药既有全身作用,也有局部调节;既能促进骨生 成,也可抑制骨吸收,是通过多靶点多环节的综合作 用达到防治绝经后骨质疏松的目的. 2.肾虚与动物模型” 妇女绝经或人为去除卵巢后骨骼的改变中,主 要以松质骨的丢失明显,而皮质骨丢失较少,骨密度 下降和骨形成指标ALP,OC大大升高等为特点.在 对绝经后骨质疏松的研究中,通过摘除卵巢可以制 造成功理想的骨质疏松动物模型.多数研究选择大 鼠作为研究对象,因为去卵巢大鼠动物模型几乎完 整地再现了绝经后骨质疏松的发展过程.同时.去 卵巢动物也是中医界认可的研究肾主骨良好摸塑. 特别在摘除卵巢后早期阶段,动物常表现出一系列 董}嘶 “ 嘟嘟眦 0O0000 耋}瞄瞄嘶瞄 蚰 董}瞄瞄 0O0000 828940 1】】2 ?????? 3O7302 ii 65170, 012223n? 博扯 LMH 中国骨质蘸钕杂志2002年2月第8巷第l塑 典型的肾阳虚症状,用补肾药物治疗可使这些症状 缓解或消失,证明此模型的可靠性.近年来随着转 基因和基因敲陈动物的大量涌现,部分学者认为小 鼠也可作为研究骨质疏松的理想模型,但目前关于 这方面的研究报道还较少.本实验中我们采用摘除 雌性昆明小鼠卵巢作为研究对象,发现成年小鼠在 去卵巢4周后,出现股骨骨密度降低,骨形成指标 ALP,OC升高,骨的生物力学性能降低等变化,这些 改变与妇女绝经后骨质疏松的改变类似,我们的实 验证明.去卵巢小鼠既是较理想的骨质疏松动物模 型,也是理想的肾虚模型,而且还具有来源方便,价 廉等优点. 3AS.RKCH对骨形成指标的影响” 成骨细胞是骨代谢的重要功能细胞.成骨细胞 内含有大量韵ALP,血中AlJP的40%,50%来源于 骨,ALP的活性可反映成骨细胞,特别是新形成的成 骨细胞的活性及状态.雌激素减少或缺乏使其对破 骨作用的抑制解除,骨吸收显着增加,随之骨形成也 增加.即高转换型骨质疏松,使得ALP值也升高. 另外.高转换型骨质疏松的主要生化特征之一,是 OC的增高.OC是由成骨细胞合成和分泌的特异性 非胶原蛋白,代表骨的形成状况.当骨的形成与骨 的吸收偶联时,OC值代表了骨转换速率的快慢,而 当骨形成与骨吸收脱偶联时,则反映骨形成的情况. 本实验中小鼠卵巢摘除后骨密度降低,骨丢失增多, 反映骨形成的指标ALP,OC也明显增高,符合绝经 后骨质疏松症的病理特点,表明去卵巢后骨吸收增 加与骨形成增加同时存在.AS.RKCH阻止去卵巢 小鼠血清ALP,OC的升高,显示使其降低骨转换的 作用,虽然降低血清ALP和OC的作用远远低于雌 激素,但增加骨密度的作用则与雌激素的效果相同. 我们认为这可能是AS.RKCH纠正了因雌激素水平 低下导致骨转换率增加,改善骨吸收与骨形成偶联 失衡状况,同时促进了骨的形成,只有这样才有可能 使骨密度增加. 4对骨生物力学的影响.” 骨质量包括骨的结构,骨量和骨的强度3个方 面,只有动物实验能提供可能性来直接检测骨的这 3个方面的参数.对小鼠骨生物力学测试以弯曲试 验最适用,常用的为3点弯曲试验.测定骨组织在 外力作用下的力学特性和骨在受力后的生物学效 应,是对骨质量进行评定的一种可靠方法.本实验 中小鼠击卵巢后4周,其结构力学参数明显下降,表 明去卵巢后骨抵抗变形和破坏的能力下降,雌激素 可显着阻止骨结构力学性能的下降.骨质疏松模型 小鼠用AS~RKCH后其最大载荷,弹性载荷,巍度及 变形挠度等结构力学参数都有提高,表明AS-RKCH 可提高骨骼抵抗外力冲击的能力.其他关于补肾中 药对去卵巢动物模型骨生物力学性能研究有限的报 道与本实验一致,表明补肾中药可提高击卵巢骨质 疏松模型动物骨生物力学性能,增加骨组织的承载 能力,提高骨骼抵抗外力冲击的能力,可有效地防治 去卵巢后I起的骨质疏松,减少骨折的发生. 5AS—RKCH作用的物质基础 中药复方是在中医理论指导下,根据”君臣佐 使”的组成原则,有多种单味药构成的统一体.而中 药复方长期临床应用有效的物质基础正是其中的化 学成分.从研究有效的化学成分的角度出发,可以 把中药复方看成为以下3种状态:(1)复方中药的有 效成分是每味中药的有效成分的总和,其药理作用 是每个有效成分的加和,协同,或互补.(2)复方中 药的有效成分不仅是每味中药有效成分的总和,还 在复方中药在作成制剂时各种成分的相互作用,这 些相互作用有简单的物理变化,也有复杂的化学变 化,各种成分的相互作用可以改变各种成分的溶出 性质和凝集状态,也可以在发生化学反应后产生新 的物质.(3)复方中药的复杂成分最终要被体内吸 收进人血液,从而发挥药理作用.因此可以暂时不 考虑复方中药到底有多少成分,而只考虑在血液中 发挥生理效应的哪些成分.这些成分部分以游离状 态存在,部分与大分子结合的状态存在.因此,研究 复方制剂在血液中的可检测成分及其相应的药理作 用,可以直接了解复方中药真正起作用的化学物质. AS.RKCH是从临床有效的经典补肾复方中经一定 工艺提取而来.原方在临床应用中发现治疗更年期 综合症有好的疗效,表现出部分雌激素样效应,动物 实验也证实有弱雌激素样作用,因此推测,此复方中 应该含有能与雌激素(ER)受体结合或起作用的物 质. 有关植物雌激素的研究成果给予我们很好的启 示.植物雌激素是存在于植物药之中,具有能与ER 结合,诱导产生雌激素样作用的一娄化学物质.自 1926年首次报道植物提取物具有雌激素样活性以 来,已发现有数百种植物含有雌激素样活性成分. 研究较清楚的主要有异黄酮(ia~alm),术脂素 (1ignan)和香豆雌酚(~oumestro1).由于异黄酮的结 中国骨质疏格杂志2OO2年2月第B鸯第1期ChinJ0m帅P 一.Feb2,O02.V8.Ho.1 构和分子与E,类似,能与Ell竞争性结合,但其活 性仅为E,的1/10C0,因此表现出弱雌激素活性或抗 雌激素活性,被认为是防治绝经相关疾病的天然药 物而成为人们关注的热点.人体试验也初步证明植 物雌激素及其类似物可使绝经后老年骨质疏松患者 储备和骨密度改善,骨代谢指标变化;抑制绝经前, 围绝经期妇女的骨密度和骨量的丢失,有效地预防 绝经后骨质疏松.异黄酮的作用类似于选择性雌激 素受体调节剂,对子宫无明显刺激作用,可预防和降 低乳腺癌的发病率.异黄酮的弱雌激素作用在减少 围绝经期潮热和阴道干涩症状,预防心血管疾病等 方面显现出良好的前景. 总之,本实验为中医”肾主骨”理论提供了实验 证据,证明补肾中药对防止去卵巢后雌激素缺乏引 起的骨质丢失有良好的作用,植物雌激素的研究进 展为阐明中药复方的复杂作用机制中的部分通路提 供了可参考的依据.根据已有的资料显示,补肾中 药复方组成的方药中含有异黄酮,谷甾醇等植物 雌激案成分,有理由推测,AS.RKCH表现出的 雌激素样作用与其组成中的异黄酮成分有关,但详 尽的作用机理还有待于进一步的深入研究. 参考文献 1豫毂云,卞如濂,陈惨.主编药理实验方法学第2版北京:人 民卫生出版社.19911293?1297 2施备鼓,痛着医学实验动物学西安:陕西科学技术出版杜. 1989.352-354 3王学蔓,戴力明,韩健.等龟地散与钙剂对击卵巢大鼠骨重量, 量密度,骨强度的影响.中国骨质疏橙杂志.2OOO,6(1):74. 4秦岭,集国蔷.骨生物力学在陆止骨质疏松药物开发药物中的应 用基础.中国骨质疏橙杂志.2OOO,6(I):23.25,68 5FI蛐i啪JL.H删approachesIothetI口肌Iofo搴叮0幽CI1-rOpiD Cb鲫B瑚.2OOO.4:383-3帕 6NnfCsDdopbenlPanelOst~isP陀”ntI锄.dimB. ?dIh.JAMM,2001,6:785?795 7刘患厚,主缩.骨质疏橙学.北京|苇}学出版杜,1998.529.534. 8丁桂芝,刘忠厚,周勇中西医结合防治骨质疏橙基础与临床研 究进晨.中国骨质疏橙杂志,1997.2:81.” 9王文健.肾主骨理论与中西医结合治疗骨质疏松症的临床研究. 中国量质疏橙杂志.1998,4(4):444 1O王吕生,许昕,金敬善.等益肾坚骨丸治疗女性骨质疏橙症的临 床研究.中国骨质疏橙杂志,1997.3(4):61.63 n沈暑,杜靖远.杨家玉.等朴肾法防治绝经后妇女骨质丢失的临 床研究中国中西医结合杂志,1994.14(9):515.518. 12卞美曩,王萤.裒莉云.等骨橙宝在手术绝经后扫女预防和治疗 量质琉梧症的初步观察中国量质疏橙杂意,1995,4(4):56-59. 13王健智.玛坤,张灵蒲,等.中药坚臂颗粒对卵巢切除后骨质琉橙 大鼠骨骼力学性能的影响中医正量.1999.Il(7):6-7 ?吕肖峰.叶雪清.补肾中药和雌激素对击势雌性大一下丘脑内源 性阿片肽影响的研究中医杂志.1988.29(5):58-59 I5都柬强.藏克戎击势法建立骨质疏格宴验模型的动物选择爰评 价.中华宴验外科杂志,1998.I5{3):286_287 16IsY.AH.WD雌X,elalDt峨黼’瑚弛山醴弘 geDi~tein?k口eaI-d山erIlBi盯ecIq酬m_眦.?hemBph,B R曙C衄删口.2幔.274:~-701PMID:IO92433B. I7M】…s,Hb出RR.TellA.杜.虮eII舯n蜘一0f femalemi?dllrjIl菖rd叩m衄曲yo咖ocI咖 n自adulthoodB0口e.2o呻.27:47-52. 18Y~ekiK.YadaM.1iT.d.s印r??0fI删一? lh日I【hy眦印e呲m啊l.0P日ec啪捌 raleeBi0IPh蚍nBdI.1999.22:92924. 19Gur?血曙CMBjochecInaeb0ne邛d呻(R;ew).Olin LMd.2OOO.20:489-50I 20”EL盼Cr吼C.SItM,elBh髑dcdmBd?0fbnh TnBl…the曲ud,0fP0I皿口.pau辅I蚰0p.r曲.0呻roht.I螂, B:147.I5I 2Il~kerAC,B丑I1DC.Ch~utCH.el.C岫cd1_e0f0cIlemic m吐目0fbcnell…l叫?日aI-d如击r日0雎(fk. )0Dpm?h,珊,11:467-480. 221n盯CH.}hielIYF.MuIlerR.H.V丑L;叽iT-b饵呻由姐 pmpee日,mmcm忙,aI-ddcn呻BXItm?mK删i?bmice JBMr.200I,16:206.213. 23KleinRF.sIl蛆M.C咖嘲ME,el.H口啪-icI盯i盟t0f cebredlIiadl吐b嘶e叫嘴.】B0M盯R鹧,2001, 16:63-71 24Akht~MP.1蛐iecUT,C0惭MA..geneticn自b帅e density.曲抛or—mm唧,虮dslmniT-岫i.C~leal明Jelm,2OOO. 67?337-344 25毗咖sM,?【舢s.GI】…M,H.Ba脯咖哪mc aI-d一c柚m叫mIi曙in睫l岫m咂yg嘴如r?dtc dop?m.B,2O?,M:l5-19. 26J—T.Jov啪P,IZ.et.0埘曲n0f山r?-p耐nitberIl罾 I嘲nPhet?mp?t6dI卿r?p柚-lyBindtc e帕【io玎ofLbeIn】ol1,蚰dm山.B咄,l998,23:155- I6I 27np耐ALseIe叽g胁叩瑚血I岫ph岫o. ?mmlbep嘴I?leI?n?.aiIIc. 1999.6:6Ol郴. 28Vin~ntA?FHbc?LxI枷?岫d塘ylb出lin啊脚p札特? MBv0ClinP聃,2OOO.75:1174-ll” 29l~iralY?M—c,ch—MI曲BIein,be蝴 i吕.IIe,?B-b?IPl叩幽自b0nel嘴棚us档响0叽dd. eie~~y.En,1,4:1993-1900. 30F删】P,MMc,cIIEzTheI?l’I【emdI】c. eshD口e1o船m.且riecl0mr山0n叫口0r啪lnt,I998,3: 274_281 31C,B.m口et蚰-P自帅C,clI|脚B.s【蛳且’硼 d岫e-dep目口dy-ede枷av盯h?由n帆m薯Bbedo t邮p嘶ia?dql’m酬豫b.J‰,20013:7?饼.