【doc】苛求芽孢杆菌尿囊酸酰胺水解酶性质的研究

【doc】苛求芽孢杆菌尿囊酸酰胺水解酶性质的研究 苛求芽孢杆菌尿囊酸酰胺水解酶性质的研 究 ',Gl/,,一3. 202微牛物学通报 苛求芽孢杆菌尿囊酸酰胺水解酶性质的研究 徐志伟————— ————— —/ (福建省亚热带植物研究所.厘门361006】 ChrisvanderDrift (荷兰奈梅根大学微生物学与进化生物学系) 7. 996年23(4) ? 摘要研究了苛求芽孢杆菌尿囊酸酰胺水解酶的基本性质,稳定性及调节粗酶作用于尿囊酸的K为 71mmol/L,v…为5mol/L?min,?m.蛋白质co,Ni抖cd可部分代替Mn作为金 属辅因子,活力分别为对照的17%14%和I1%Fe,CuZn2+分别抑制酶活力(%):16,40和100 CoNi,Cd2+存在时,酶活力被抑制(%):58,28和59酶贮于-20"C6个月未失活研究了酶的热稳 定性和pH稳定性.该酶对乙醇相当敏感.测试了近60种化合物对酶反应的效应,其中己二酰朦,羟基 脲草酸延胡索酸柠檬酸.苹果酸,草酰己酸,丙酮酸己酰氧肟酸(全为10mmol/L),3—磷酸甘油 酸,氨基氧己酸(全为5mmol/L)分别抑制酶活力(%):10,70,10,10,1020,50,4095,23和44. 关键词苛求芽孢杆菌,酰脲,尿囊酸酰眩解酶,性质 .——————————一,——————————,'——一 作为嘌呤降饵的一部分,尿囊酸可由尿囊 酸咪基水解酶[EC3.5.3.4】或尿囊酸酰胺水解酶 【EC3.5_3.9]降解".最近,尿囊酸酰胺水解酶 研究受到特别重视,它在大豆固氮输出产物酰 脲分解代谢中占有重要地位",但活力极低并 易失活而难以研究已研究过的微生物尿囊 酸酰胺水解酶均是以半失活状态存在,但可被 pH6及EDTA或低pH(<5)激活.'. 苛求芽孢杆菌是一种土壤微生物,仅能生 长在尿酸,尿囊素作为氮源的培养基上,降解尿 囊酸的酶为尿囊酸酰胺水解酶,因而该菌是 研究尿囊酸酰胺水解酶的极好材料.用磷酸缓 冲液提取,该酶活力很低,但可被酸激活.我 们研究过该酶的激活与失活至今,有关尿 囊酸酰胺水勰酶的报道极少,仅研究过 Streptococcusallantoicus等的尿囊酸酰胺水解 酶的一些性质…本文报道苛求芽孢杆菌 尿囊酸酰胺水解酶的一些基本性质,稳定性及 调节作用. 1材料和方法 1.1菌种夏培养基 苛求芽孢杆菌(Bacillusfidiosus DSM83)在37?振荡(200r/mln)培养,培养 基按文献,补加30mmol/L尿囊素作为唯 一 碳源和氮源,灭菌后的pH为7.2. 1.2酶液的制备 细菌培养2411,离心(10000g,30min)收 集细胞,用含0.17mmol/LEDTA的 50mmol/LTris-HCl(pH7.5)缓冲液洗涤两 次,离心后,沉淀悬浮于同一缓冲液中,高压破 碎(138MPa).离心(43000g,30min,4?) 后,上清液作为酶源. 1.3尿囊酸酰胺水解酶活力测定 除非另外说明,每ml反应液含: 50tmaol/L尿囊酸钠,0.15/tmol/LMnSO, 1.06/tmol/L还原型谷胱甘肚,150/tmol/L j乙醇胺一HCl缓冲液(pH8.8),以及适量的酶 (5--l5飑粗蛋白);37?下反应30min缺酶 作为对照.根据乙醛酸衍生物差级 本文完成于荷兰奈梅根^学徽,物学与进化牛物学系 Mariecune创新基金资助. 1995-l】一O2收穑 1996年23(41微生物学通报 法"测定酶反应产物脲基乙醇酸.在所用的 分析条件下,每min催化l~mol/L产物形成 作为一个酶活力单位. 1.4蛋白质测定 以牛血清蛋白作为,采用Bio-Rad蛋 白质分析试剂,按考马斯亮蓝染色法"J测定. 所有数值为三个重复的平均值. 1.5试剂 尿囊酸钠根据尿囊素碱解制备113];其它试 剂至少为分析级试剂. 2结果和讨论 2.1反应进程 粗酶比活力为24.5mol脲基乙醇酸? min,-mg一蛋白质. 在每ml反应液含12.75,ug蛋白质条件下, 至少60min内,反应产物量随反应时间线性增 加. 2.2酶量及底物浓度对反应的影响 在每ml反应液含25,ug蛋白质的范围内, 反应速度与蛋白质浓度线性相关. 在选定的最适条件下,测定了底物尿囊酸 浓度对反应的影响,在反应之前,先根据方 法"校正尿囊酸试剂浓度.根据 Lineweaver-Burk法作图,苛求芽孢杆菌尿囊 酸酰胺水解酶粗酶反应的K为 7.1mmol/L尿囊酸钠,Vx=5Omol. mln--m蛋白质. 2.3金属离子对反应的影响 Mn是苛求芽孢杆菌尿囊酸酰胺水解酶 的金属辅因子,但Mn可被部分二价金属离 子取代.Mg抖,Car+,Fe2十,Zn2+,cu (O.3mmol/L)不能替代Mn的作用,但 Co2+, Ni2+ ,Cd(0.3mmol/L)可部分代替 Mn作为金属辅因子,活力分别为Mn"作为 辅因子时的17%,l4%和l1%. 在反应液含有0.15mmol/LMn2-条件 下,测试了二价离子(0.3mmol/L)对酶反应 的影响.Mg和Ca无效应.Fe,Cu和 zn2分别抑制16%,4o‰和100%.而可部分 替代Mn作为辅因子的co",N,cd一存在 时,对酶反应也产生不良影响,它们分别抑制 58%,28%和59%这明,金属离子之问相 互影响. 在金属离子特异性方面,大豆尿囊酸酰胺 水解酶有所不同,Mg",c,Fe,Co和 Nj"都不能代替Mn.作为辅因子 2.4稳定性 2.4.1贮存:苛求芽孢杆菌尿囊酸酰胺水解酶 在提取缓冲液中,于一2O?低温冰箱内贮存6 个月未失活. 2.4.2热稳定性:在含0.17mtool/LEDTA 的50mmol/LTris-HC1缓冲液(pH7.5)中, 30?以上该酶不稳定.44.5t处理5min,酶活 力失去5O%.在55"C和7O?处理5min,活力 失去75%和100%. 2.4.3不同缓冲液中的稳定性:酶在不同pH 缓冲液中,分别在55t(O,30min)30t(O, 40min)和4t(O~20min)下处理. 在pH8.8(300mtool/L二乙醇胺-HCI, 0.1mmol/LMn),PH7.5f50mmol/L Tris—HCl,0.17mtool/LEDTA)和口H6.0 (60mtool/LN2HPO4--NaH2PO4,0.17m m01/LEDTA),55E处理(图1a)后,活力迅 速下降:在处理5min时,残存活力分别为 7O%,25%和10%.结果表明在55t处理时, pH8.8并含有Mn"的条件下,该酶较稳定.该 酶反应的最适pH为8_8,且需要Mn作为辅 因子 在30iC和4t处理(图lb,lc)该酶在 pH7.5(50mtool/LTris-HCl,0.17mmol/L EDTA)缓冲液中比在pH6.0(60mtool/L Na2HPO4--Nail2PO4,0.174mmol/LEDTA) 缓冲液中较为稳定.其中pH6.0(60mmol/L N%HPO4-NaH2P04,0.174mtool/LEDTA) 能在短时问内显示激活作用.酶在pH7.5 (50mmol/LTris-HCl,0.17mmol/L EDTA),4t下20rain内未失去任何活力. 2.4.4在乙醇中的稳定性 在66%乙醇(4?)存在下,lmin内该酶完 2O4微生物学通报 圈1温度及pH对酶稳定性的影响 a55?.b3O?,c4? ?pH88,0.pH75,[pH6.0 全失活,而且稀释200倍后无法恢复活力.在 67%乙醇(4?)存在下,1min内,该酶失活 lO%,以后随处理时间逐渐失活,25rain时,该 酶失活17%.在6.7%乙醇处理情况下,测定 酶活力时,经乙醇处理的酶液稀释2O倍,在最 后酶反应液中仍含有0.33%乙醇. 尿囊酸酰胺水解酶对乙醇较敏感的性质, 与尿囊酸脒基水解酶(尿囊酸酶)或尿囊素酶有 明显的区别.后两者对乙醇较不敏感,可用乙 醇或丙酮分部提取. 2.5底物类似物以及其它化台物的影响 在酶反应的最适条件下,分别测试了近60 种化合物对酶反应的影响.仅l1种化合物部 分抑制尿囊酸酰胺水解酶(表1).而次黄嘌 呤,黄嘌呤,鸟嘌呤,腺嘌呤,腺嘌呤核苷,尿嘧 啶核苷(均为5mmol/L)以及二氢尿嘧淀,5一 甲基尿嘧啶,5一氨基尿嘧啶,尿囊素,5一甲基尿 囊素,乙内酰脲,脲基乙酸,6一氰基嘌呤,2,脱氧 腺苷(均为2mmol/L),四氧嘧啶,甘油酸,乙 酰脲,戊二酸,乙醇酸,脲基乙酮酸,磷酸甘油, 甘氨酸,丝氨酸,谷氨酸,谷氨酰胺,r氨基丁 996证23(4) 酸,一酮戊二酸,丙氨酸,天冬氨酸,天冬酰胺, 精氨酸,瓜氨酸,琥珀酸,K2HPO4,KNO3, KC1,(NH4),SO4(以上均为10mmol/L),N一 乙酰一L一天冬酰胺,N一乙酰一L一天冬氨酸,N一 乙酰一谷氨酰胺,果糖,乙酸钠,乙酰磷酸,l,6, , ?磷酸果糖(均为5mtool/L),KCN,NaN1 (1mmol/L),尿素(1,20mmol/L),十二烷 基磺酸钠(O.5,2mmol/L)对酶反应均无影 响. 表1一些化台物对尿囊酸酰胺水解酶的影响 效应物抑制 (【rLmot/L)(%) 嫂应物抑制 (【rLmo【/L)(%) 乙二酰脲【0 羟基脲,10 草酸,10 氟基氧乙酸,5 卜磷酸袖酸,5 乙酰氧肟酸,10 10 70 【0 44 23 95 延胡索酸,10 柠檬酸,【0 苹果酸,【0 草酰乙酸,10 丙酮酸,l0 10 10 20 50 40 本文首次较系统地研究了底物及其它一些 化合物对尿囊酸酰胺水解酶的影响,以上化合 物绝大部分是第一次作为效应物测试.至今, 还未能找到该酶的特异抑制剂.微生物或植物 尿囊酸酰胺水解酶的纯化,特征,调节与定位等 都是空白点,均有待研究. 参考文献 …VogelsGDBJochemBiophysAcU,1966,113:277 291 f2】vogelsGD,VanderDriftCBacteriologicalReviews, 1976,40{2):403,468 嘲3WinklerRG.PolaccoJC,B[evinsDG,Randa?DD PlantPslot,1985,79:787,793 Lukaszcwsk~KM,BlevinsDG.RandallDDPLant Physiol,l2,99:167O,l676 『515VanderDriftC,VogelsGDEnzymologia,1969,36: 269,277. 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KeywordsBacillusfastidiOSU$,Ureides,AIlantoateamidohydrolase,Properties CarriedoutinDept.ofMicrobiologyandEvolutionaryBiology,Univ.ofNUmegenandsup— portedbyMarieCurieInitiativeFellowship 中国微生物学会1996年下半年学术会议计划