【doc】HPLC-ELSD法测定阿卡波糖发酵液中麦芽糖、葡萄糖和阿卡波糖的含量

【doc】HPLC-ELSD法测定阿卡波糖发酵液中麦芽糖、葡萄糖和阿卡波糖的含量 HPLC-ELSD法测定阿卡波糖发酵液中麦 芽糖、葡萄糖和阿卡波糖的含量 772中国抗生素杂志2011年l0月第36卷第10gq 文章编号:1001—8689(2011)OLO一0772.03 HPLC.ELSD法测定阿卡波糖发酵液中 麦芽糖,葡萄糖和阿卡波糖的含量 孙敏王欣荣 (中医药集团总公司四川抗菌素工业研究所,成都610051) 摘要:目的建立HPLC—ELSD法测定阿卡波糖发酵液中麦芽糖,葡萄糖和阿卡波糖的含量.方法采用lnertsil氨基柱 (4.6mmx250mm,5"m),柱温:30?;乙腈一水(75:25)为流动相,流速:1.3mL/mimELSD气化室温度95~C;气体流速:3L/min; 体j:1.5×10sPa.结果麦芽糖在8-400gg范围内与峰面积有良好的线性关系(O.9991),葡萄糖在4~200gg范围内峰 …仃良盘『的线性关系(O.9994),阿]波糖在1.6-80gg范围内与峰面积有良好的线性关系(0.9985),葡萄糖峰,麦芽糖峰和 波糖峰完分离.结论方法可靠,简便,准确,可用于问时检测阿卡波糖发酵液中底物和产物. 关键词:高效液相色谱法;蒸发光散射法;麦芽糖;葡萄糖;阿卡波糖;发酵液 中图分类号:R97文献标识码:A Determinationofmaltose,glucoseandacarboseinacarbose fermentationbrothbyHPLC-ELSD SunMinandWangXin—rong (ChinaNationalPharmaceuticalGroupCorporation,SichuanIndustrialInstituteofAntibiot ics,Chengdu610051) AbstractToestablishanHPLC—ELSDmethodforthedeterminationofmaltose.glucoseandacarboseinacarbose fermentationbroth.MethodColumn:InertsilNH(4.6mmx250mm,5gm),Columntemperat ure:30?;Mobilephase: acetonitrile.water(75:25).flowrate:1.3mL/min;ELSDtemperatureofdrifttube:95?:gasflow:3L/min;gaspressure: 1.5×10Pa.ResultsTheassaydisplayedgoodlinearity,thelinearrangeofmaltosewas8-400gg(,=0 .9991),thatof glucosewas4,200pgfr=O.9994)andthatofacarbosewas1.6,80ggfr=O.9985).ConclusionThemethodiSsimple andcanbeusedfordeterminationofmaltose,glucoseandacarboseinacarbosefermentationb roth. KevwordsHPLC:ELSD:Maltose;Glucose;Acarbose;Fermentationbroth 阿波糖足一个假性四聚糖,属于【1一葡萄糖苷 悔抑制剂.阿卜波糖在肠道内竞争性抑制葡萄糖苷 水解酶,抑制多糖及舣糖分解成葡萄糖,使糖的吸 收相应减缓,此,具有使饭后血糖降低的作用. 波糖作J{j机理清楚,疗效确切,毒副作用低, j一要J1?治疗I【型糖尿病,但是如果I型糖尿病病 人用胰岛索治疗的『西J时加用阿卡波糖,则可以改 收稿日期:2010.11—02 基金项目:霞火新药创制(编号:2011zX09401—403?lO) 作者简介:孙坝,女,生于l969年,研究员. 善血糖控制,减少餐后早期高血糖和餐后晚期低血 糖,并可使每天胰岛素需要量减少.目前,阿卡波 糖作为一线药物用于糖尿病的治疗. 阿卡波糖是由游动放线菌发酵产生,麦芽糖和 葡萄糖为阿卡波糖生物合成的前体…,在发酵过程 中添加麦芽糖和葡萄糖,能促进阿卡波糖的合成. 麦芽糖和葡萄糖对阿卡波糖的促进作用与糖的添加 HPLC.ELSD法测定阿卡波糖发酵液中麦芽糖,葡萄糖和阿卡波糖的含量孙敏等 773 时间,浓度和比例有关,为了提高阿卡波糖的生成 量,必须不断的:捡测发酵液中的麦芽糖和葡萄糖以 及阿卡波糖的浓度,并根据微生物代谢情况及时调 整前体的补加,最大限度促进阿卡波糖生成. 麦芽糖和葡萄糖都是还原糖,无紫外吸收,目 前,在国家标准中,采用碳水化合物分析柱,示差 折光检测器来测定两者的含量[.阿卡波糖为一假四 糖,有一双键,目前生产和研究中多采用部颁标准 和欧洲药典收载的高效液相色谱法来测定.该方法 采用紫外检测器来测定其含量,检测波长为210nm. 本文首次采用氨基柱,蒸发光散射检测的HPLC方 法,同时检测麦芽糖,葡萄糖和阿卡波糖的含量, 该方法快速,灵敏,定量重现性好. 1材料和方法 1.1菌种 游动放线菌ctinoplanessp.CK2019,四川抗菌 素工业研究所菌种保藏中心保藏. 1.2仪器与试剂 岛津LC.1OAT高效液相色谱仪;Alltech2000蒸 发光散射检测器;葡萄糖和麦芽糖购自成都市科龙 化工试剂厂;阿卡波糖由本所自制;乙腈(HPLC)购 自Fisher公司. 1.3色谱条件 色谱柱为Inertsil氨基柱(250mm~4.6mm,5gin, GLSciencesInc.);流动相为乙腈.水(75:25);流 速:1.3mL/min;ELSD气化室温度95?;气体流 速:3L/min;气体压力:1.5X105Pa;柱温:30?; 进样量:20gL. 1.4对照品溶液的配制 精密称定麦芽糖1000mg.葡萄糖500mg和阿卡 波糖200mg,混合,加入50%的甲醇配制成每毫升含 麦芽糖20mg,葡萄糖10mg和阿卡波糖4mg的对照品 储备液. 精密吸取5mI,对照品储备液,置于1OmL容量瓶 中,加入50%的甲醇配制成每毫升含麦芽糖1Omg, 葡萄糖5mg和阿卡波糖2mg的对照品溶液. 1.5供试品的制备 发酵液经滤纸过滤后,准确吸取滤液2mL于试 管中,加入75%甲醇4mL,充分摇匀,倒入离心管 中,离2(8000r/min)10min,取上清液经0.45~tm微孔 滤膜过滤后进行分析. 2结果与分析 2.1系统适用性实验和标准曲线的绘制 精密吸取供试品溶液按1.3项下色谱条件进行测 定,葡萄糖,麦芽糖峰和阿卡波糖及其他相关物质 的峰的分离度大于1.5. 吸取对照品储备液0.2,0.5,1,2,4,6和 8mL,置入10mL容量瓶中,50%甲醇定容.依次取对 照品储备液及其稀释液注入液相色谱仪,按1.3项下 色谱条件进行测定,峰面积,以峰面积的常用对 数为纵坐标,以进样量的常用对数为横坐标,绘制标 准曲线,回归方程分别为葡萄糖=1.0495x+5.5945, r=0.9994;麦芽糖=1.0133x+5.8924,r=O.9991;阿一g- 波糖1.0133x+5.6715,r=0.9985.麦芽糖在8,400gg 范围内,葡萄糖在4,200g范围内和阿卡波糖在 1.6~80gg范围内与峰面积线形关系良好. 2.2精密度试验 精密吸取对照品溶液20gL,重复进样6次,测得 葡萄糖峰面积对数值的相对标准偏差为0.098%,麦 芽糖峰面积对数值的相对标准偏差为0.141%和阿卡 波糖峰面积对数值的相对标准偏差0.072%,表明该 方法精密度良好. 2-3重复性试验 取同一发酵液样品6份,按1.5项下方法处理样 品,并按1.3项下色谱条件进行测定,测得葡萄糖含 量的相对标准偏差为1.38%,麦芽糖含量的相对标 准偏差为1.82%和阿卡波糖含量的相对标准偏差为 1.95%,表明该方法重复性好. 2.4回收率试验 取发酵液样品,测定其中的葡萄糖,麦芽糖和 阿卡波糖含量,然后加入其含量80%,100%和l2O% 的葡萄糖,麦芽糖和阿卡波糖,按1.5法处理后按 1-3项下色谱条件测定.结果葡萄糖的平均回收率为 100.54%,相对标准偏差1.95%;麦芽糖的平均回收 率为1O0.83%,相对标准偏差2.36%;阿卡波糖的平 均回收率为99.69%,相对标准偏差2.22%,表明该方 法准确可靠. 2.5发酵液测定 分别精密吸取对照品储备溶液5uL,10gL, 20gL与供试品溶液(按1.5法处~)20gL,注入液相色 谱仪,按1.3项下色谱条件测定,以葡萄糖,麦芽糖 和阿卡波糖进样量的常用对数与相应峰面积的常用 对数计算各自的回归方程,并根据回归方程,分别 计算样品中葡萄糖,麦芽糖和阿卡波糖的含量.结果见图1表1. 3结论与讨论 774中国抗生索杂忐20l1年l0月第36卷第l0 葡萄精 1.I,, 女茅瓣 波精 ,,, \…— \,一… ,, ,,,…… 图1发酵液的HPLC图 Fig.1Chromatogramoffermentationbroth 表1发酵液测定结果 Tab.1Contentsoffermentationbroth (1)葡萄糖和麦芽糖无紫外吸收,不能用紫外检 测器检测;阿卡波糖虽然可以用紫外检测器检测, 但其为末端吸收,检测灵敏度较低.用蒸发光散 射检测器检测,不仅町以同时检测上述三个糖,而 H.宵足够的灵敏度,并可减少温度和流动相溶剂的 l卜扰. (2采片jHPLC—ELSD同时测定了阿卡波糖发酵液 中葡萄糖,麦芽糖和阿卡波糖的含量,该方法精密 度高,重复性好,分离效果佳.葡萄糖,麦芽糖和 l;lI』波糖与其他峰的分离良好.该方法简单快速, 能准确的测定阿卡波糖发酵液中底物和产物的含 量,从而为生产过程中的代谢调控提供及时和准确 的指导,以获取最高的发酵单位和节约生产成本. 参考文献 『11LeeS,SauerbreiB,NiggemannJ,eta1.Biosyntheticstudieson the0【一glucosidaseinhibitoracarboseinactinoplanessp.:Source ofthemaltoseunit[J].JAntibiot,1997,50(11):954—960. 『21GB/T18932.22—2003.蜂蜜中糖,葡萄糖,蔗糖,麦芽 糖含量的测定方法液相色谱示差折光检测法is]. [3]WS1一(X一315)一2004ZDrugSpecificationsPromulgatedby MinistryofPublicHealth,PRChina[S】. 『41TheEuropeanPharmacopoeia5.1,Strasbourg,France:the DirectoratefortheQualityofMedicineoftheCouncilof Europe[S].2005:2873—2874. 『51Melissawilcos.HPLC—ELSD法分析橙汁中的碳水化合物 [C].蒸发光散射检测器文集(第i版),天国奥泰科技(ti )有限公司:l67—168. " ? , 一 l}{{{}___ji}i,?===_二 一