中性粒细胞和内皮细胞凋亡及相关因子改变在晚期创伤性脓毒症发病中的作用

中性粒细胞和内皮细胞凋亡及相关因子改变在晚期创伤性脓毒症发病中的作用 中性粒细胞和内皮细胞凋亡及相关因子改 变在晚期创伤性脓毒症发病中的作用 ? 686中华创伤杂志2006年9月第22卷第9期ChinJTrauma,September2006,V.N 中性粒细胞和内皮细胞凋亡及相关因子 改变在晚期创伤性脓毒症 发病中的作用 魏宇森廖玉华褚淑娟周全军王国荣王朝晖程龙献 【摘要】目的探讨中性粒细胞及内皮细胞凋亡及相关细胞因子和凝血因子改变是否参与晚 期创伤性脓毒症的发病.收集晚期创伤性脓毒症患者外周血,分离培养外周血单个核细胞 (PBMC)及中性粒细胞,观察创伤性脓毒症患者中性粒细胞和内皮细胞凋亡情况,并检测PBMC培养 上清白细胞介素(IL)一4,IL—l0以及外周血组织因子(TF),血管性血友病因子(vwF)的水平,比较 晚期创伤性脓毒症组与对照组的差异.结果晚期创伤性脓毒症组中性粒细胞凋亡水平[(37? 21)%]和循环内皮细胞凋亡[(774?211)个/rn1]水平显着高于非脓毒症创伤组[(16?9)%,(92? 72)个/rn1]和正常对照组.晚期创伤性脓毒症组抗炎细胞因子(IL一4,IL—l0)及凝血因子(TF, vWF)水平显着高于对照组.结论晚期创伤性脓毒症患者存在免疫功能抑制和凝血功能异常, 这可能是晚期创伤性脓毒症的特征之一,并可能是晚期创伤性脓毒症多脏器功能障碍发生的重要机 制. 【关键词】脓毒症;中性粒细胞;内皮细胞;细胞凋亡 Roleofapoptosisofneutrophi~andvascularendothelialcellsandchangesofrelativefactorsinthe pathogenesisoftraumaticsepsisattheadvancedstageWElYu—miao.L1AOYu— hua.CHUShu— juan,ZHOUQMnjun,WANGGuo—rong,WANGChao—hui,CHENGLong— xian.DepartmentofCardiolo— gY,UnionHospital,TongfiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan 43oo22.China 【Abstract】0bjectiveToexploretheroleofapoptosisofneutrophilsandvascularendothelial cellsandchangesofrelativecytokinesandthromboticfactorsinthepathogenesisoftraumaticsepsisatthe advancedstage.MethodsThevenousbloodwascollectedfromthepatientswithtraumaticsepsisat advancedstageandtraumaticpatientswithoutsepsisandhealthysubjects.Theperipheralbloodmononu— clearcells(PBMC)andneutrophilswereisolatedandcultured.Theapoptosisofneutrophilsandvascular endothelialcellswasassayed.andthelevelofIL一4,IL一 10inPBMCculturesupernatantsweredeter— mined,andthetissuefactor(TF)andvWfactor(vWF)ofperipheralplasmaweremeasured.Results Thepercentagesofapoptosisofneutrophilsandnumbersofapoptoticcirculatingvascularendothelialcells werehigherthanthatoftraumaticpatientswithoutsepsisandhealthycontrolssignificantly.Andthelevels ofanti—inflammatorycytokinesIL一4.IL一 10andthromboticfactorsTF.vWFintraumaticsepsiswere elevatedthanthato— ftraumaticpatientswithoutsepsisandcontrolstoo.ConclusionImmunesuppres— sionandabnormalthromboticstatemaybeonecharacteristicoftraumaticsepsisatadvanceds tage,which perhapsinvolvedsinthepathogenesisoftraumaticsepsisattheadvancedstageandmultipleor gandys— functionsyndrome. 【Keywords】Sepsis;Neutrophil;Endothelialcells;Apoptosis 严重创伤常常由于合并严重感染而导致脓毒症 产生,后者已成为创伤晚期导致患者死亡的最常见 的原因.目前,脓毒症的机制远未能明确,治疗效果 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30300133) 作者单位:430022武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医 院心内科(魏宇淼,廖玉华,王朝晖,程龙献),重症监护病房(褚淑 娟,周全军),综合科(王国荣) ? 临床研究? 也没有根本性突破….一般认为,创伤性脓毒症及 其多脏器功能障碍的发生与感染诱发的炎症反应密 切相关.虽然脓毒症患者炎症介质及炎症细胞功能 状态研究较多,但在脓毒症的不同阶段其特征可能 存在差异.另外,脓毒症晚期除炎症介质损害外,脏 器微循环功能受损可能是导致脓毒症晚期多脏器功 能障碍的重要机制.笔者收集11例晚期创伤性脓 毕创伤杂志2006年9门第22卷第9期ChinJTrauma,September2006,Vo1.22,No.9 毒症患者,检测了其外周血中性粒细胞及循环内皮 细胞凋亡情况,以及相应的细胞因子和凝血因子,探 讨炎症状态及微循环异常在晚期创伤性脓毒症及其 多脏器功能障碍发病中的作用. 1临床资料与方法 1.1研究对象 收集我院2005年l1月一l2月期间住院脓毒 症患者ll例,其中男性6例,女性5例;年龄(474- 8)岁.均合并严重感染,其中腹部创伤并结肠穿孑L 并腹膜炎4例,多发挤压伤并感染2例,多发开放性 骨折并感染2例,多发胸腹创伤并感染2例,腹部手 术合并感染l例.ll例患者血培养阳性5例,3例 为大肠杆菌,l例金黄色葡萄球菌,l例皮葡萄球 菌.ll例患者均伴有全身炎症反应综合征的2项 以上,符合脓毒症诊断标准,以脓毒症发病7 d以上作为晚期脓毒症的参考标准.ll例晚期 创伤性脓毒症患者多合并严重脏器功能障碍,其中 脓毒症休克5例,急性.肾功能衰竭2例,急性呼吸窘 迫综合征l例,弥散性血管内凝血l例.取患者发 病7d以上的外周血.取相似创伤患者不伴脓毒症 的患者5例(均为多发创伤)作为对照.另取4例 正常成年人作为对照.3组发病年龄及性别特征基 本匹配.所有研究对象于研究日上午8:o0,10:o0 问采血备用. 1.2中性粒细胞的分离及培养 取健康人外周静脉血l0ml,加入肝素抗凝试管, 加入Ficoll—Hypaque细胞分层液(美国PharmacBio— tech公司)离心分离中性粒细胞.洗涤分离的中性粒 细胞,培养于含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640 培养基(GIBCO—BRL),细胞密度l0个/ml,以细胞 形态学鉴定中性粒细胞,碘化丙啶法测定细胞存活比 率. 1.3外周血单个核细胞的分离及培养 取不同创伤性脓毒症组,非脓毒症创伤组以及 正常对照组的外周血l0ml,加入肝素抗凝试管,同 上法以淋巴细胞分层液密度梯度离心法分离单个核 细胞(PBMC),分离的PBMC用磷酸盐缓冲液 (PBS)冲洗后混悬于含2.5g/L牛血清白蛋白的 RPMI1640培养液.分离的PBMC通过非特异性酯 酶染色鉴定,培养24h后行取上清行白细胞介素 (IL)一4及IL—l0测定.另取患者血液l0ml,同上 法分离PBMC,置PBS巾行凋亡内皮细胞流式细胞 术 1.4外周血血浆及血清标本制备 同时取创伤性脓毒症患者,非脓毒症创伤患者 以及正常对照组外周血标本5ml,常规方法分离其 血清低温保存备用.并取上述患者血液标本2.7ml 加入38L枸橼酸钠0.3ml抗凝(血:抗凝剂=9 :1),离心取血浆,低温冻存备用. 1.5中性粒细胞凋亡检测 取培养于RPMI1640培养基中的l0细胞数的 中性粒细胞与等量的不同患者的血清混合孵育24h. 以TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)测 定中性粒细胞凋亡情况.凋亡细胞的形态特征为细 胞体积缩小,染色质致密化或碎点状,呈现异硫氰酸 荧光素(FITC)染色亮荧光.每片计数细胞500个,计 算其凋亡比率. 1.6血清IL一4及IL—l0检测 收集培养24h的PBMC,取其上清,以抗人IL 一 4及IL—l0抗体,用酶联免疫吸附(ELISA) 法检测晚期创伤性脓毒症及非脓毒症创伤组患者 IL一4及IL—l0水平.具体操作按其说明书完成, 测定敏感度为5pg/ml.测量结果通过自动血细胞 计数器将测定结果调整为pg/10个细胞. 1.7凋亡内皮细胞流式测定 凋亡的内皮细胞磷脂酰丝氨酸由胞内转移到胞 外,可与膜联蛋白AnnexinV特异结合,另以鼠抗人 CD146抗体孵育细胞用以识别内皮细胞源性 (CD146为成熟内皮细胞的特异性表达抗原),行流 式细胞术.取分离的PBMC,PBS重悬细胞为l0细 胞/ml.加入20L包被有偶合藻红蛋白的鼠抗人 CD146抗体(ChemiconTemecula)孵育.离心后加 入FITC—AnnexinV标记液重悬细胞,孵育液再次 冲洗,加入荧光SA—FLOUS溶液孵育后经流式分析 (BectonDickinsonFACSCalibur).流式细胞仪激发 波长488nm,波长为515nm的通带滤器检测FITC 荧光. 1.8血浆组织因子(TF),血管性血友病因子 (vWF)测定 晚期创伤性脓毒症及非脓毒症创伤组及正常对 照组血浆标本TF,vwF采用ELISA法测定.具体操 作按照其检测试剂盒说明书进行.TF测定试剂盒 购自美国Diagnostica公司(ADI)的ActiChromeTF ActivityAssay药盒,以发色底物法确定TF活性. vWF试剂盒购自太阳生物技术公司提供的vwF含 量检测药盒. 1.9统计学分析 数据以l【?拄示,用Iw…Ils1ln统 汁软f牛进行缝汁学处埋.多}lrh"较采?1因素 力蓐5]-J~ji,iJ2步行l比较 2结果 2I巾rf牝细胞州ik榆删结果 晚j_;l1胜崽昔_m浦蚺荞陛绌胞作用 24h听lIH粒恤州率为{37?2l111"恍壮 刨伤纰血消培非l!f'Jrt'牡钏L幢胞州r半为(16? 0)%,常州为【】2?7)%与差抒析提示 差异仃统II学意艾cI(1】(15)缸期肿毒组嗣 半高}脓毒刨竹】组垃I.精刊肌胡(P<0u5) 而?_脓毒症创绢硬_E帛f照卦l莘辑尢统汁学意辽 (I'>u051巾1~2~~zf'lll/],NI'L?榆洲闭l 22外问血内f~IT[胞州L扮il~!ll结 晚刮伤脓毒l旬f774?2lI)1I哝 毒疝刨伤埘勺(92?72)1Vin1.II常照组(49? 4I)个---j置分析,组r1IJ肆有统Il学卷义(/< 00I).晚L【月脓毒痒心扦细胞州!酱多r两埘 L(,J<]1)f表流?见2 目lit,忭靴rrIm悱?包m姐膏fE^状}理?乜《七?^EIxIfxmn… I#罐1.-唑蚺刨{fill盎 O j :oo 23l'HMI:培养1.清II4歧IIl(J{24血浆TF搜vwFlxln均{盘删 扼J创伤性脓l1—4歧II…盘较非晚期刨协J脓毒症组较宙毒症刨协纽I『『L浆 TF 脓毒grlfJ~}'[1显并高fP<0{II)表I醍vWF嘲菁升岛(P<0OI)表2 表I并细?川于倚删帕牲{,?表2抨【T_?f}0州I19?牧 中华创伤杂志2006年9月第22卷第9期ChinJFrauma,September2006,Vo1.22,No.9 3讨论 一 般认为,脓毒症是机体对严重感染而产生的失 控的炎症反应,不是感染本身,而是异常增高的炎 症反应最终导致了机体的损害.多数研究表明,脓 毒症的发生与大量肿瘤坏死因子一(TNF—),lL, 113等细胞因子和炎症细胞的活跃反应有关,这可能是 脓毒症早期发病的关键因素之一.但最近这一理论 受到了质疑,脓毒症晚期存在脾脏及胸腺淋巴细胞的 广泛凋亡,表明存在免疫抑制.给脓毒症患者使用 集落刺激因子以增强中性粒细胞的功能和炎症反应 强度也未见脏器损害的加重,并且几乎各种炎症介质 的阻滞剂均未能在脓毒症的临床试验中证实有效. 这提示,可能与脓毒症早期不同,脓毒症晚期尤其是 严重脓毒症晚期可能存在过度的机体反应的下降,免 疫功能的抑制可能是晚期脓毒症患者的特征之一,并 且可能是炎症反应无法控制和多脏器损害的机制之 一 .笔者发现,晚期创伤性脓毒症患者存在显着增多 的中性粒细胞凋亡,中性粒细胞是炎症反应的重要效 应细胞,中性粒细胞凋亡的增加可能是免疫功能抑制 的体现之一.不同于细胞坏死,细胞凋亡是机体主动 的适应性反应之一,中性粒细胞凋亡的形成主要与机 体免疫功能的凋节有关.笔者还发现,晚期脓毒症患 者抗炎细胞因子lL一4及IL一10分泌增加,而非脓毒 症创伤患者机体中性粒细胞功能状态和相关细胞因 子无显着改变,JL一4及JL一10是Th2淋巴细胞分泌 的代表性细胞因子,具有抑制细胞免疫,促进粒细胞 凋亡的作用.两者同时存在于晚期脓毒症患者之 问,说明机体免疫功能的抑制可能参与了晚期创伤性 脓毒症的发病. 同时,脓毒症晚期常常合并多脏器功能障碍甚至 脓毒性休克,说明严重晚期脓毒症患者机体功能状态 和内环境进一步恶化,是一系统性损害,其机制可能 与脏器微循环受损有关,与脓毒症导致的内皮受损和 凝血功能状态改变有关'..本研究结果表明,晚期脓 毒症患者外周血凋亡内皮细胞增多,提示凋亡内皮细 胞可能是晚期脓毒症的特征之一和多脏器功能障碍 形成的重要因素.凋亡内皮细胞膜磷脂转位,为凝血 反应提供反应界面,具有显着的促凝活性,另外,凋亡 内皮细胞可分泌TF,降低TF途径抑制物的合成及分 泌,暴露内皮下胶原成分,促进血小板的黏附和聚集. 微循环内皮细胞的弥漫性凋亡脱落,最终可能促使微 血栓的形成而产生微循环阻塞和脏器损害.本研究 结果表明,脓毒症患者血循环存在TF及vwF异常升 高,提示高凝状态是脓毒症脏器损害产生的重要因 素.TF是外源性凝血系统的启动因子,凋亡内皮细胞 具有分泌TF的作用,从而参与血栓的形成.循环 vWF主要来自内皮细胞,一旦内皮细胞受损,合成和 释放vWF增加,vWF连接血小板糖蛋白受体,加速血 小板黏附,聚集,同时,vwF是完整的?因子的一部 分,为凝血提供反应的界面,参与微血栓的形成. 总之,脓毒症晚期由于广泛的内皮凋亡和凝血活 化,最终可导致凝血状态的改变,参与多脏器损害的 产生.炎症免疫系统与凝血系统有着密切的内在联 系,在脓毒症晚期,免疫功能的抑制和部分抑制性细 胞因子分泌的增加也可能参与了内皮细胞的凋亡,促 进了高凝状态的形成,同时,凝血因子的活化也可能 是炎症细胞功能改变的因素之一.但其具体细节和 机制还有待深入研究. 4参考文献 1MartinGS,ManninoDM,EatonS,eta1.Theepidemiologyofsepsisin theUnitedStatesfrom1979through2000.NEnglJMed,2003,348: l546一l554 2LevyMM,FinkMP,MarshallJC,eta1.2001SCCM/ESICM/ACCP/ ATS/SISIntemation'dSepsisDefinitionsConference.IntensiveCare Med.2003,29:530—538. 3HotehkissRS,TinsleyKW,SwansonPE,eta1Depletionofdendritic cells,butnotmacrophages,inpatientswithsepsis.Jhnmunol,2OO2, 168:2493—2500. 4HotchkissRS,KarlIE.Thepathophysioh)gyandtreatnlentofsepsis.N EnglJMed.2003,348:138—150. 5GorserS,CromptonNE,'FolkersG.etal,Increasedradiationtoxicity byenhancedapoptoticclearanceofHL一60aJIsinthepresenceofthe pentapeptidethymopention,whichselectivelybindstoapoptoticcells. Nature.1997.390:350—351. 6Air(]WC.Theroleoftheendotheliuminseveresepsisandmultipleor— gandysfunctionsyndromeBlood,2003,101:3765—3777. (收稿日期:2006—05,20) (本文编辑:何跃)