抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体轻链可变区的克隆及序列分析

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体轻链可变区的克隆及序列分析 抗 O 型口蹄疫病毒单克隆抗体轻链 可变区的克隆及序列分析 宋 帅 , 林 彤 , 邵军军 , 丛国正 , 独军政 , 高闪电 , 常惠芸 ( 中国农业科学院 兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽)病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室 , 甘肃 兰州 730046 摘 要 : 应用分子生物学技术 , 从分泌抗 O 型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞 9F12 中提取总 RNA , 经 反转录 , PCR 扩增及克隆 , 得到 V基因 。序列测定结果表明 , 9F12 的 V基因为 336 bp , 可编码 112 个氨基酸 。L L 用 NCBI GenBank 分析表明 , V基因符合小鼠抗体可变区特征 , 为功能性重排的抗体可变区基因 。根据 Kabat 分 L κ类体系 , 9F12 的 V基因片段隶属于抗体轻链 20 家族 。9F12 的 V基因的克隆为抗 O 型口蹄疫病毒单链抗体的 L L 构建与表达奠定了基础 。 关键词 : O 型口蹄疫病毒 ; 单克隆抗体 ; 轻链可变区 ; 基因克隆 ; 序列分析() 中图分类号 : S85216 文章编号 : 052829017 20090420809203 文献标识码 : B ()口蹄疫病毒 foot2and2mouth disease virus FMDV , 从 分 泌 抗 O 本试验 采 用 抗 体 基 因 工 程 技 术 ( ) 是小 RNA 病 毒 科 picornaviridae 口 蹄 疫 病 毒 属型 FMDV 的杂交瘤细胞中提取总 RNA , 逆转录合成 1 () aphthovirus的成员, 偶蹄动物对该病毒极为敏 cDNA , 以此为利用 PCR 方法扩增出轻链可变 感 , 可造成患病动物的口 、蹄和乳房等部位发生水 区基因 , 并进行了序列测定和分析 , 旨在为构建抗 疱 , 破溃并形成烂斑 , 发病率几乎达 100 % 。鉴于 ( ) FMDV 单链抗体 scFv奠定基础 。现将有关结果 口蹄疫病毒对畜牧业生产和发展造成的巨大危害 , 报道如下 。 ( ) 世界 动 物 卫 生 组 织 OIE和 联 合 国 粮 农 组 织 ( ) FAO将其列为 A 类动物传染病之首 。因此 , 对 1 材料与方法 FMDV 的免疫和控制显得尤为重要 。而 FMDV 现有 7 个血清型 , 各血清型之间不能产生交叉免疫 , 但 111 细胞 、质粒及菌株 各血清型之间有不同程度的交叉反应 , 这种特性给 分泌抗 O 型 FMDV 单克隆抗体的杂交瘤细胞 株 9F12 由 本 室 制 备 及 保 存 , 单 克 隆 抗 体 为 IgG1 2 型 ; p GEM T2easy Vector 为 Promega 公司产品 ; 感受 FMDV 的诊断和疫苗免疫带来了极大的困难。单 () 态细胞 JM109 购自宝生物 大连公司 。克隆抗体与抗原结合的特异性强 , 从而使单抗在 112 主要试剂FMDV 的研究中发挥了重要的作用 。但由于杂交瘤 RNeasy Mini kit 购自 Qiagen 公司 , AMV 反转录 细胞的制备步骤烦琐 , 筛选费时 , 且培养杂交瘤细 ( ) 酶 、Oligo dT、连接酶为 Promega 公司产品 , 限 15 胞需要复杂而昂贵的细胞生长培养液 , 这给单克隆 IPTG、X2gal 、Taq DNA 聚合酶 、 制性核酸内切酶 、抗体技术在 FMDV 防治领域中的广泛应用带来了一 DNA Marker 、DNA 片 段 纯 化 试 剂 盒 均 购 自 宝 生 物 定限制 。随着 DNA 重组技术和 PCR 技术的诞生 , () 大连公司 , 其它试剂均为国产或进口分析纯 。形成了以基因工程方法构建重组菌并以此为生物反 113 PCR 扩增引物根据应器研制基因工程抗体的生物高技术 , 它为大量生 3 GenBank 中查找到的编码小鼠 IgG V 区基因序 产廉价的抗体提供了一条新思路。基因工程抗体L 4 的构建其关键之一是抗体可变区基因的获得。列中相对保守的框架区 FR1 、FR4 的基因片段核苷 收稿日期 : 2009205211 ()基金项目 : 国家科技支撑项目 No 2006BAD06A14 ; No 2006BAD06A10 () 作者简介 : 宋 帅 1982 - , 男 , 河南汝州人 , 硕士生 , 主要从事病毒基因工程研究工作 。E2mail : Songshuai0602 @1261com 。 810 2009 年第 4 期 酸序列 , 设计了 V区的上 、下游引物 , 引物核苷 cDNA , PCR 扩增后经 1 %琼脂糖凝胶电泳得到一条 L ( ) 分子量约 330 bp 的目的条带 图 1, 未见其它非 酸序列如下 : 特异性产物 , 与预计的抗体轻链可变区基因分子量 () VFor 29: 5′2GGATCAAGTTGGTCCACCATCA2L 大小相符 。将凝胶纯化的 PCR 扩增产物与 p GEM T2 GCCCGTT23′; easy 载体16 ?连接 12 h 后 , 转化 JM109 , 挑取白色 () VBack 23: 5′2GACATTCTGMTSACMCAGMC2L 单个菌落制备质粒 , 经 PCR 、酶切鉴定片段大小与 TCC23′。 预期结果相符 。 其中 : W = AΠT , M = AΠC 。 114 总 RNA 提取 、反转录 从液氮罐中取出冻存 的抗 O 型 FMDV 杂交瘤 细胞株 9F12 , 复苏后用含 10 %胎 牛 血 清 的 RPMI27 - 1 1640 培养至细胞总数约为 2 ×10。2 000 rm?in 离 心 10 min 后 , 收集细胞 , 然后参考 RNeasy Mini kit 操作 说 明 提 取 细 胞 中 的 总 RNA , 并 进 行 反 转 录 。 μμ 反转 录 体 系 为 : 总 RNA 1 g , dNTP 2 L , Oligo ( ) μμμ dT015L , 5 ×RT buffer 4L , 反转录酶 015L ,15 图 1 单抗 9F12 V基因的 PCR 扩增电泳图谱 L μμRNA 酶抑制剂 015L , 加双蒸水至 20 L 体系 。混 99 ?水浴 5 min , 冰浴 匀后置于42 ?水浴 215 h , 212 V基因核苷酸序列的测定及分析 冷却备用 。L 115 V基因的扩增用 BigDyeTeminator v311 Cycle Sequencing Kit , 对L ( ) μ9F12 的 V基因核苷酸序列进行了测定 图 2。与PCR 反应体系为 : 10 ×PCR buffer 5 dNTP L ,L Kabat 数据库中已发表的鼠抗体可变区序列进行比 μμμ 4L , 上 、下 游 引 物 各 1L , cDNA 5 L , Taq 酶κ较分析 , V基因 V基因片段隶属于抗体轻链 20 L L μμ 015L , 加双蒸水至 50 L 体系 ; 反应程序如下 :家族 , 全 长 336 bp , 可 编 码 112 个 氨 基 酸 。经 与 95 ? 5 min , 94 ?1 min , 55 ?30 s , 72 ?2 min ,NCB I GenBank 作 Blast 对 V基因进行同源性分析表 L 1 %琼脂糖电泳 35 个循环后 , 72 ?终延伸 10 min ; 明 , 所得到的 V基因符合小鼠抗体可变区框架结 L 观察结果 。构 , 有明确的 4 个 FR 区和 3 个 CDR 区 。 116 V基因的克隆L 将纯化的 PCR 产物和 p GEM T2easy 载体于16 ? 3 小结和讨论 水浴进行连接反应 , 转化感受态细胞 JM109 , 均匀 涂布于含有 IPTG、X2gal 和 Amp 的 LB 琼脂平板上 ,Ig 基因结构与功能研究的不断深入 , 已 随着 37 ?温育 12 h 后 , 挑取白色单个菌落 。以碱裂解经知道 Ig 基因由三组不连锁的基因群控制 , 分别 将 , 并进行酶切和 PCR 鉴定 , 法小剂量制备质粒 κλ为重链基因 , 轻链基因和轻链基因 。在未分化 初步鉴定为阳性的重组质粒进行测序 。 的胚系 B 淋巴细胞和其他有核体细胞的染色体中 , 117 V基因的序列测定及分析L 编码 IgV 区和 C 区各部位的基因节段是相互分离 序 列 测 定 反 应 试 剂 为 : BigDyeTeminator v311 的 。轻链 V 区基因由 V 、J 两组基因节段构成 , 在 () Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems。测序所用 B 细胞分化发育过程中 , 通过一部分基因节段相互 ( ) 引物 : F Primer M13247 : CGCCA GGGTT TTCCC 连接 , 基因重排 , 形成功能性 V 区基因 , 由于 V 、 TM AGTCA CGAC。测序仪为 : AB I PRISM377XL DNA J 基因段组合性连接的多样性 , 构成了抗体的多样 5 Sequencer 。对 V基因的序列测定后 , 按 Kabat 等 性 。利用基因工程从分泌单抗的杂交瘤细胞中分离 L 和克隆抗体可变区基因是构建基因工程抗体的途径 的方法对 V基因片段进行序列分析 。L 之一 , 其关键是抗体可变区基因的获得 , 抗体基因 2 结果和分析 的正确拼接及有生物活性的抗体分子表达 。其中抗 体可变区基因的获得是至关重要的第 1 步 , 它必须 211 V基因的 RT2PCR 扩增和克隆 L 解决 V基因 PCR 扩增引物正确设计的问题 。我们 L 提取 杂 交 瘤 细 胞 总 RNA 后 , 反 转 录 得 到 图 2 轻链可变区基因序列及推导的氨基酸序列 应用随机引物寡聚核苷酸逆转录合成第 1 链 cDNA , 参考文献 : 它能 够 保 持 编 码 区 及 5′端 序 列 的 完 整 性 。依 据6 1 ] 谢庆阁. 口蹄疫M . 北京 : 中国农业出版社 , 2004 : 16 - Orlandi 等对复杂多变的抗体基因序列进行计算机 17 . 分析得出的在各种抗体 V 区 FR1 5′端和 FR4 3′端的 2 ] Domingo E , Escamis C , Baranowski E , et al . Evolution of foot2 核苷酸序列有极高同源性的特征 , 针对 V 区 FR1 5′ ( ) and2mouth disease virus J . Virus research , 2003 , 91 1: 47 端和 FR4 3′端最保守序列设计了扩增 V的 PCR 引L - 63 . 物 。应用设计合成的引物 VFor 、VBack 以 9F12 L L 3 ] Skerra A , Pluckthum A. Assembly of a functional immunoglobulin 第 1 链为模板进行 PCR 扩增 , 分离克隆了目的基 Fv fragment in Escherichia coli J . Science , 1989 , 240 : 1038 - 因 V, 对重组质粒 9F12 p GEM T2easy2V用 EcoR I L L 1041 . 酶切能切出目的条带 V。说明所设计的这一套引 4 ] Li J , Wang Y , Wang Z , et al . Influences of amino acid sequences L in FR1 region on binding activity of the scFv and Fab of an antibody 物适用单抗 9F12 V基因的克隆 。尽管难以证实所 L of human gastric cancer cells J . Immunol . Letters , 2000 , 71 : 用引物序列与单抗 9F12 V的 FR1 5′端和 FR4 3′端 L 157 - 165 . 序列完全匹配 , 但即使少数几个碱基不严格配对 , 5 ] Kabat E A , Wu T T , Perry H H , et al . Sequence of proteins of 由此造成的突变也不会影响克隆到的 V基因表达 L Immunological Interest , 5thedn M . NH Washing D C : 1991 . Us Department of Health and Human Services , Public Health 7 Service . 的抗体片段结合抗原的活性。本试验克隆的 VL 6 ] Orlandi R , Gussow D H , Jones P T , et al . Cloning immunoglobulin 经测序表明 , V基因由 336bp 组成 , 计算机分析 L variable domains for expression by the polymerase chain reaction 结果表明克隆的 V基因符合小鼠抗体可变区特征 , L J . Proc Natl Acad Sci USA , 1989 , 86 : 3833 - 3837 . 为功能性重排的抗体可变区基因 。这就进一步证明 7 ] Froyen G , Hendrix D , Ronsse I , et al . Effect of VH and 本试验成功克隆了单抗 9F12V基因 , 也为通过基 L Vconsensus sequence2 specific primers on the binding and L 因重组技术构建抗 FMDV scFv 奠定了良好的基础 。 neutralizing potential of a single2chain Fv directed towards HuIFN2 与单抗比较基因工程抗体的生产具有操作简便 , 表 gamma J . Mol Immunol , 1995 , 32 : 515 - 521 . 8 达量大 , 成本低廉的特点, 用克隆的 V 区基因 Winter G , Milistein C. Man2made antibodies J , Nature , 1991 , 8 ] 9 可产生与抗原特异性结合的抗体片段, 利用基因 349 : 293 - 299 . 突变技术改变抗体的某些结构可提高抗体的亲和 Benhar I , Pastan I. Identification of residues that stabillize the 9 ] 10 力 , 延长其半衰期。可以预测 , 作为被动免疫 single2chain Fv of monoclonal antibodies B3 J . J Biol Chem , 抗体的抗 FMDV scFv 的构建和应用将有助于我国对 1995 , 270 : 23373 - 23380 . FMDV 的防制 。 Mats O , Henrik O , Michael M , et al . Liggt chain shuffing of a high 10 affinity antibody results in a drift in epitope recognition J . Mol Immunol , 1996 , 33 : 47 - 56 .