野油菜黄单胞菌原生质体形成及再生条件的研究

野油菜黄单胞菌原生质体形成及再生条件的研究 : , , , , 酶作用时间、作用温度, 在 3 种不同的渗透压稳定剂中进行处理, 记录其原生质体形成率和再生率。结 果: 选用对数生长早中期的菌体, 用 10 ƒ的溶菌酶液在 30?时酶解 30 , 采用以蔗糖为主的渗透压稳定剂, 野油菜黄单胞菌原生质体的 Λgm l m in 形成和再生最佳。结 论: 野油菜黄单胞菌可形成原生质体并进行再生。 关键词 野油菜黄单胞菌; 原生质体; 形成; 再生 9391112中国图资料分类法分类号Q A STUDY O N THE CO ND IT IO NS FO R THE FO RM A T IO N A ND REGENER- A T IO N O F XA NTHOM O NA S CAM PESTR IS PRO TO PL A ST )(530021 , , L iu J in D ep a r tm en t o f M ic ro b io lo gy and Imm uno lo gyGuangx i M ed ica l U n ive r sityN ann ingA bstrac t O bjec t ive: T o inve st iga te th e m o st app rop r ia te co nd it io n s fo r th e fo rm a t io n o f X an thom o na s cam p e st r is . : p ro top la stM e thodsA g row th cu rve o f X an thom o na s cam p e st r is w a s co n st ruc ted acco rd ing to th e cu lt iva t io n . . , t im eT h e effec t s o f t rea t ing Xcam p e st r is o f d iffe ren t ce ll age w ith ly so zym e o f d iffe ren t co ncen t ra t io n sand d if2 , fe ren t cu lt iva t io n t im e so sm o t ic stab ilize r s and tem p e ra tu re s o n th e fo rm a t io n and gene ra t io n o f th e p ro top la st s . : , 10 ? ƒ3030 , in th e m ed ia w e re o b se rvedRe sultsC e lls in th e ea r ly lo g stageΛgm l ly so zym e a t fo r m inu te sand suc ro se a s o sm o t ic stab ilize r a re th e m o st app rop r ia te co nd it io n s fo r th e fo rm a t io n and regene ra t io n o f th e p ro to - . : .p la stCon c lus ionX an thom o na s cam p e st r is can fo rm and regene ra te p ro top la st ; ; Key words X an thom o na s cam p e st r isp ro top la stfo rm a t io n and regene ra t io n () 野油菜黄单胞菌 为 , 现将结果报道如下。究X an thom o n a s cam p e st r is 革兰氏阴性菌, 成熟的菌体外有一层厚厚的荚膜, 是 1 材料和方法() , 一种胞外多糖, 称黄原胶它具有X an th an gum 良好的增粘性、 触变性、 悬浮性、 耐酸碱、 抗盐碱111 材料 等多方面性能, 在食品、 纺织、 涂料、 原油开采等 (11111 菌种: 野油菜黄单胞菌 广西农学院分离, 1 方面具有广泛的应用。因此, 对该菌种进行选育, )实验室传代。提高其生产黄原胶的产量和性能, 具有重要的现实 () 11112 培养基: 液体培养基 % 为蔗糖 115, 蛋 意义。 近年来, 用原生质体融合及直接诱变原生质 白胨 015, 牛肉膏 013, 酵母膏 011, 7; 固体培 pH 2 , 4 体进行育种的方法屡有报道。 要取得融合成功 () 养基 % 为液体培养基中加入琼脂 210; 高渗培养 和有效诱变, 首先需要对细胞壁进行消化, 形成大 基为固体培养基中加入渗透压稳定剂。 量的原生质体, 并使原生质体能高频率地再生细胞 ( 11113 试剂: 溶菌酶液 500 华美公司提ƒm g L 壁。 由于各种微生物细胞壁组成和结构不同, 以及 菌龄、 酶解条件、 渗透压稳定剂等因素的影响, 制 ) 供; 渗透压稳定剂: ?018 102 ƒ, 0ƒm o lL N aC lm o l备特定菌种原生质体所需条件不同, 我们对野油菜 ; ?015 蔗糖, 0102 ; ƒƒL M gC l2m o lL m o lL M gC l2黄单胞菌原生质体形成及再生的适宜条件进行了研 ?015 蔗糖, 0102 , 0102 ƒƒƒm o lL m o lL M gC l2 m o l 顺丁烯二酸。 L 112 方法 收稿日期: 1997- 07- 14 11211 菌种活化: 挑取保藏菌种, 划斜面 28?培养 3 。 d 11212 生长曲线测定: 将用液体培养基活化的菌种 按 4% 接种量接入 250 锥形瓶, 28?振荡培养,m l 每隔 1 取样测。h OD 620 11213 原生质体的制备: 将活化的菌种 28?振荡 培养, 取灭菌的离心管加入菌液 5 ƒ支, 6 000 ƒm lr 离心 15 , 收集菌体。用 5 高渗液悬浮菌m in m in m l 体, 加酶液,水浴。再 6 000 离心 15 , 弃ƒrm in m in 上清, 用 5 高渗液悬浮原生质体备用。 m l 图 2 菌龄对原生质体形成率及再生率的影响11214 原生质体的再生: 取原菌液及原生质体制备 形成率, 再生率a b 液, 分别用无菌水释稀, 涂布于普通培养基平板, 28?培养, 候长出菌落计数。 同时将原生质体制备 液用高渗液稀释, 涂布于高渗培养基平板, 计数菌 落。 2 结果 211 野油菜黄单胞菌生长曲线见图 1。该菌 6 后 h 进入对数生长期, 18 后进入稳定期, 此时镜检, 可 h 观察到有荚膜形成。 212 原生质体的形成和再生 5 21211 形成率和再生率的计算: 图 3 酶浓度对原生质体形成率及再生率的影响 () 形成率= - ×100%ƒA B A 形成率, 再生率a b ()() ƒ- - 再生率= C B A B ×100% 为原菌数, 为未形成原生质体的菌数, 为 A B C 原生质体再生数与未形成原生质体的菌数之和。 21212 菌龄对原生质体形成率及再生率的影响见 图 2。 21213 酶浓度对原生质体形成率及再生率的影响 见图 3。 21214 酶解温度对原生质体形成率及再生率的影 响见图 4。 图 4 酶解温度对原生质体形成率及再生率的影响 形成率, 再生率a b 21215 渗透压稳定剂对原生质体形成率和再生 的影响见表 1。 表 1 渗透压稳定剂对原生质体形成率及再生率的影响 ( ) ( ) 渗透压稳定剂形成率 % 再生率% 018 ,102 13 08m o l N aC l 98 m o l M gC l2 1416 0102 45 015 蔗糖,m o l M gC l2 m o l 1318 015 m o l 蔗糖, 0102 m o l M gC l, 46 2 0102 顺丁烯二酸m o l 21216 原生质体形成及再生现象观察: 取原菌液 图 1 野油菜黄单胞菌的生长曲线 酶解后的原生质体制备液, 相差显微镜观察, 可 立起来的 , 其关键步骤是细胞壁的去除, 形成活的的保护作用。 () 本文承蒙郑薛斌教授热情指导, 特此致谢 原生质体, 并能再生。 我们的研究结果, 可初步确 定野油菜黄单胞菌原生质体形成及再生的适宜条 参考文献件。 1 J eane s A , Po lym e r J. Sym po sium. Sc i, 1974, 45: 209 311 由该菌的生长曲线可知, 它进入稳定期时会有 , , , . 2 Co e tzeeJN S irge l FA L eca t sa s GGene t ic recom b ina2 荚膜形成, 培养物的粘度增大。 而溶菌酶的作用位 . t io n in fu sed sp h e rop la st s o f p ro v idence a lca lifac ien sJ 点在细胞壁的肽聚糖上, 荚膜阻碍酶的作用, 因此, , 1979, 114: 313Gen M ic ro b io lo gy 在实验中应选用未形成荚膜的菌体来制备原生质 赵 敏, 谢风龙 1 小诺霉素生产菌棘孢小单孢菌突变菌 3 体, 即在菌体进入稳定期前。 在此期间, 原生质体 株原生质体形成、再生及融合的研究 1 中国抗生素杂志, 的形成率随菌龄增大而逐渐下降, 再生率则增加 () 1995, 20 1: 10 冯清平, 薛林贵 1 复合诱变原生质体选育耐热碱性蛋白 ( ) 图 2, 推测幼小的细胞壁较之老化的更易被酶消 4 () 酶高产菌 1 微生物学报, 1996, 36 1: 453 化, 因此原生质体形成率高, 而老熟菌体对环境抵 乔宝义, 徐 浩 1 棒状杆菌原生质体的形成、再生及融合 5 抗力强, 即使失去细胞壁, 细胞内的生理状况和生 () 的初步探讨 1 微生物学报, 1983, 23 1: 33 鄂 征 1 组 织 培 养 技 术 1 北 京: 人 民 卫 生 出 版 社, 化代谢受到的影响也许较微, 故细胞壁的再生也较 19821283 6 易。 综合考虑这两个因素, 我们选用对数生长早中 冯清平, 薛林贵 1 地衣芽孢杆菌原生质体最佳形成和再 期的菌体来研究其它因素的影响。 () 生条件的研究 1 微生物学报, 1997, 37 1: 73 7 312 不同细菌的细胞壁对溶菌酶的敏感性不同。有, . S ie t sm a JH D e Bo e r W RFo rm a t io n and regene ra t io n o f 5 报道先用青霉素预处理, 可增加对酶的敏感性, 或 ()2124. p ro top la st s f rom ry th ium PRL J Gen M ic ro b io l2 8 在菌株生长的延滞期加入甘氨酸, 形成率可有很大 , 1973, 74: 211o gy 7 , . F um iya su Ish ik aw aKun io O ish iFo rm a t io n and regen2 提高。本实验使用酶浓度为 10 时, 原生质 ƒΛgm l . e ra t io n o f p ro top la st s f rom co n id io bo lu s lam p rauge sJ () 体形成率已达 97% 图 3, 可知野油菜黄单胞菌对 9 , 1985, 131: 3 311Gen M ic ro b io lo gy 溶菌酶敏感, 无需进行预处理。 而且, 温度的升高 有利于酶的作用, 形成更多的原生质体; 再生则有 () 一个最适温度 图 4, 说明细胞壁的再生受菌体生