蛋白质的盐析

蛋白质的盐析 蛋白质的盐析(验证型) 一、实验目的 了解在工业化生产过程中使用(NH)SO的情况，及(NH)SO使用时的注意事项。 424424 二、实验原理 用高浓度中性盐使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法称盐析。常用的中性盐有(NH)SO、NaCl等。424高`浓度中性盐能使蛋白质沉淀是因为它具有脱水性，能脱去蛋白质胶粒水膜，又有中和蛋白质胶粒外双电层电荷的作用。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，故调节盐浓度，可适当地将蛋白质分开。如球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀，清蛋白在饱和硫酸铵溶液中沉淀，用盐析法沉淀的蛋白质并未变性，用稀释的方法或透析的方法可使之复溶。 三、器材与试剂 1、 发酵溶液 2、 10%的三氯醋酸溶液 3、 饱和(NH)SO溶液 424 4、(NH)SO粉末 424 四、实验步骤 (1) 取发酵溶液5ml，加饱和(NH)SO溶液1ml 2ml 3ml 4ml 5ml，混匀，静止数分钟，即有白色424 沉淀析出，应为何物,过滤至清，除去沉淀，滤液备用。取少量沉淀，加HO看是否复溶, 2 (2) 取滤液0.5ml，加10%的三氯醋酸数滴，有白色沉淀产生，应为何物,然后在721分光光度计OD下进行透光率的检测，检测时必须在倒入比色皿以后10秒内读取(为什么,)。(在进行检测时应600 注意将721分光光度计调整到OD;在测量前应把机器预热半小时左右。在检测时应注意有效的检测范600 围是T值15%以上到70%以下)。 (3) 另外，取滤液2.5ml于小烧杯中，加(NH)SO粉末，随加随搅拌，直至(NH)SO不能溶424424解为止，有白色沉淀产生，应为何物,然后过滤至清，除去沉淀，过滤备用。 (4) 将(1)-(3)做的滤液中加10% 三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。找到没有沉淀的加饱和(NH)4SO溶液的点。然后在721分光光度计OD下进行透光率的检测。并且作出曲线。 24600 (5) 对大量的发酵液进行处理，在滤液中加10% 三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。 (6) 盐析曲线的制作方法:如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下:取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至0?,5?，调至该蛋白质稳定的pH 值，分6,10 次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6,10 个级分，按照每次加入硫酸铵的量，查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH 缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。 五、盐析注意事项: 1.盐析的成败决定于溶液的pH 值与离子强度，溶液pH 值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。 2.盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60?烘干后再称量，这样更准确。 3.在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。 4.盐析后最好搅拌40 分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。 5.盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者G-25，G-50 处理。 6.一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。 六、盐析影响因素: 1(蛋白质的浓度:中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.5,,3.0,，相当于25 mg/mL,30mg/mL。 2(离子强度:各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。 3(盐的性质:最有效的盐是多电荷阴离子。 4(pH值:一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH 值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH 值常选在该蛋白质的等电点附近。 5(温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4?)操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25?)比0?时溶解度低，更容易盐析。蛋白质沉淀后宜在4?放3 小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。盐析时，分子量较小的蛋白质逐步沉淀下来可能就值得怀疑。具体的蛋白需要具体的摸索，当然，对肽来说，结论也是一样的。 七、思考问 1. 用高浓度中性盐盐析蛋白质时的注意事项是什么, 2. 为什么在对对大量的发酵液进行处理时的效果没有小试是的效果好,