【doc】不同厂家的银杏叶制剂对冷水负重游泳模型小鼠保护作用的比较研究

【doc】不同厂家的银杏叶制剂对冷水负重游泳模型小鼠保护作用的比较研究 不同厂家的银杏叶制剂对冷水负重游泳模 型小鼠保护作用的比较研究 2004年1月第11卷第1期中国中医药信息杂志-31? 不同厂家的银杏叶制剂对冷水负重游泳模型小鼠 保护作用的比较研究 张爱林,徐秋萍,孙建宁 (北京中医药大学,北京100102) 摘要:目的观察不同厂家银杏叶制剂(天保宁片和金纳多片)对冷水负重游泳模型 小鼠的保护作用.小 鼠8?冷水负重游泳5min,测定模型小鼠的断头喘气持续时间,并采用分光光度法 测定其脑组织生化代谢的改变. 结果与空白对照组相比,模型小鼠脑组织乳酸(LA)含量明显增加,乳酸脱氢酶 (LDH),Na-K-ATP酶,Ca-Mg— ATP酶活力明显降低(P<0,01);而2个EGB组均可以明显逆转模型小鼠上述生 化指标的改变(尸<0,05,P<0.01). 结论不同厂家生产的EGB制剂均对冷水负重游泳模型动物具有保护作用,且在对 模型小鼠脑组织生化代谢的影 响上未显示出明显差异,故均可以作为耐缺氧研究的阳性药物. 关键词:银杏叶制剂(EGB);乳酸;乳酸脱氢酶;Na-K-ATP酶;Ca-Mg-ATP酶 中图分类号:R289.11文献标识码:A文章编号:1005.5304(2004)01.0031-02 ComparisonofProtectiveEffectsoilMiceSwimminginColdWaterwithWeightLoadingof GinkgoBflobaExtractsfromDifferentCompaniesZHANGAi-lin,XUQiu-ping,SUNJian- ning (BeijingUniversityofTCM,Beijing100102,China) AImtmet:ObjectiveTocomparetheprotectiveeffectsonmiceswimmingincoldwater withweightloadingofextractsofginkgobiloba(EGB)fromdifferentcompanies,MethodsT he modelmicewasinducedbyswimmingincoldwaterwithheavyobjectsfor5minutes.Gasping timeafterheadcutOffandthebiochemicalmetabolismchangesofencephalonwere observed,ReafltsBothEGBcouldprolonggaspingtimeofthemicesignificantly,decrease cerebrallacticacidcontent,andincreasetheactivityoflactatedehydrogenase.Na.K.ATPase andCa2~_MgZ+-ATPase(P<0.05orP<0.01l,ConclusionBothEGBcanprotectmodelmice,and theydontshowapparentdifferenceinbiochemicalmetabolismchangesofencephalon,Soboth canbeusedtostudyhypoxiaduration, KeyWOldS:extractsofginkgobiloba;lacticacid;lactatedehydrogenase:Na-K~-ATPase:Ca2- Mg2+-ATPase 银杏叶制剂(EGB)成分为银杏叶提取物,主要含银杏黄酮 苷(24%)和银杏萜内酯(6%),临床已广泛用于脑血管疾病的治 疗.为对比不同厂家EGB耐缺氧作用的差异,本实验采用小 鼠8?冷水负重游泳5min造模,通过测定模型动物的断头喘 气持续时间和脑组织的生化代谢,进一步验证EGB的作用,同 时为实验研究选择合理的阳性药提供依据. I实验材料 i.i动物 ICR小鼠,雌雄兼用,体重2ig?2g,北京维通利华实验动 物技术有限公司提供,合格证号SCXK(京)2002-0003. 1,2药品 天保宁片,康恩贝集团制药有限公司生产,每片含银杏叶 提取物40mg(其中银杏总黄酮苷9.6mg),人用量3,6片/d, 批号010613-2.金纳多膜衣片,德国威玛舒培博士药厂生产, 每片含银杏叶提取物40mg(标定含银杏黄酮苷9,6mg,萜类 2.4mg),用量2,6片/d,BatchNQ,2770601,Exp:04/2006. 用前均以0.5%CMC溶液配制. i.3化学试剂 蛋白定量(双缩脲法),乳酸(LA),乳酸脱氢酶(LDH), Na一一KATP酶,cagATP酶试剂盒均由南京建成生物工 程研究所提供. 1.4仪器 HZQ—C空气浴振荡器,哈尔滨市东明医疗仪器厂生产; 400R低温离心机,德国Heraeus产品;722型分光光度计,上 海第三分析仪器厂产品:AEG一220型电子分析天平,日本 SHIMADZU产品. 2实验方法 2.i分组及给药 - 32?中国中医药信息杂志2004年1月第11卷第1期 实验动物随机分为4组,即模型对照组,空白对照组, 天保宁组(40mg/kg),金纳多组(40mg/kg).小鼠连续灌胃给 药4d,每日给药容积为20mL/kg,第4天给药60min后造模. 模型对照组和空白对照组灌服等容积的0.5%cmc溶液. 2.2造模 于小鼠尾尖部约2.5cm处系一10%体重的橡皮泥球,放 入(8?0.5)?的冷水中游泳5min(室温23~C)后,取出待测. 2.3测定方法 2.3.1断头喘气持续时间测定小鼠自冷水中取出后,在双 耳后部位迅速断头,记录从断头开始至其最后1次喘气停止 的时间作为断头喘气持续时间. 2.3.2生化指标测定断头喘气时间测定结束后,于4?冰 盘上迅速取脑,并去掉嗅球,小脑及低位脑干,称重后加9倍 生理盐水制备成10%脑匀浆备用.I|A含量,LDH活力,Na K+-ATP酶和Ca-MgZ*-ATP酶活力测定以南京建成生物工程 研究所试剂盒说明为准. 2,4统计学方法 实验结果以肚s表示,统计学处理采用t检验. 3结果(见表1,表2) 表1EGB对冷水负重游泳模型小鼠断头喘气持续时间的 影响(肚5) 注:与模型对照组比较,}尸<O.05,尸<O.O1 表2两种EGB对冷水负重游泳模型小鼠脑组织LA含量,LDH活力及ATP酶活 力的影响(肚5) 注:与模型对照组比较,}尸<0.05,尸<O.01 4讨论 与空白对照组比较,?尸<O.05,??尸<O.01;与天保宁组比较,#尸<O.05,## 尸<O.O1 本实验采用小鼠8?冷水负重游泳5min模拟临床的气 虚血瘀证动物模型.依据中医理论,一方面.模型小鼠负重 10%体重的橡皮泥球较长时间游泳,使其体力消耗,脑组织处 于严重缺氧状态,致气虚;另一方面,模型动物因处于冰水环 境中,血液遇寒则凝,血瘀;再者,气行血,气为血帅,气虚无 力推动血液运行亦可直接导致血瘀.为此,我们借此模型比 较了两种EGB益气活血产生耐缺氧作用的异同. 本实验中,模型小鼠断头喘气持续时间较空白对照组明 显延长,我们认为这与亚低温(27,35?)可降低持续升高的 颅内压,提高脑灌注压,降低脑氧代谢率l1,抑制缺氧时前列 腺素E2的过多释放,减轻神经元损伤;减慢兴奋性氨基酸 的释放速率,降低细胞外兴奋性氨基酸的浓度[33;抑制ATP 耗竭L41,从而起到脑保护作用有关.测定结果显示,给药组小 鼠的断头喘气持续时间较模型组进一步延长(P<O.05),提示 EGB可协同亚低温,进一步减少脑组织耗氧量. 模型小鼠脑组织乳酸含量的急剧增加,可加重细胞内钙 超载,促进自由基生成,严重损害神经元,神经胶质细胞以及 毛细血管内皮细胞,继而导致广泛的脑损伤].本实验结果 显示,EGB可以直接通过抑制脑组织LA水平的升高,又可间 接通过增强模型动物脑组织LDH活力,对抗乳酸酸中毒及酸 中毒后一系列有害反应的发生,从而减轻缺氧后脑损伤. ATP酶含量的变化是评定细胞代谢活动,反映神经元生 理功能的良好指标l6].模型动物脑组织Na一K一-ATP酶和Ca一 Mg一ATP酶活力下降,细胞内外离子交换不能顺利进行,最终 导致细胞结构破坏,细胞代谢紊乱.而EGB可以明显逆转这种 异常改变,增强离子泵主动转运离子的功能,以保持细胞内外 离子浓度差,增加势能贮备,为细胞的其他耗能过程提供能量. 本实验结果提示,降低模型小鼠脑组织LA含量,增强 LDH,NaKATP酶和CaMg一ATP酶活力可能是EGB产生 耐缺氧作用的重要机制.因此,天保宁片和金纳多膜衣片均 可作为耐缺氧药物开发研究的阳性药物.鉴于本实验中两种 EGB在改善模型动物脑组织生化代谢方面各具优势,究竟选 择哪一种更为恰当,应根据具体实验条件,实验要求和实验 环境而定,这样可能会更客观,更准确地评价药物的作用. 参考文献: [1]ShiozakiT,SugimotoH,TanedaM,eta1.Effectofmild hypothermiaonuncontrollableintracranialhypertensionafter severeheadinjury[J].Jneurosurg,1993,79:363. [2]ThornhillJ,AsselinJ.Theeffectofheadcoolingonthe physiologicalresponsesandresulrantneuraldamagetoglobal hemispherichypoxicischemiainprostaglandinE2treated rats[J].BrainResearch,1999,825:36. [3]NakashimaK,MichaelMT.Effectofhypothermiaontherateof excitatoryaminoacidreleaseafterischemicdepolarization[J]. Stroke,1996,27(5):913. I4]JeromeYY,AsselinJ.Effectofmildhypothermiaoncerebral (下转第35页) i豢 2004年1月第11卷第1期中国中医药信息杂志?35? 3讨论 临床实践证明,在拮抗化疗损伤方面,中医药优势独特, 具有扶正祛邪功效的复方制剂被广泛应用于临床,却因服用 不便,给药量小及炮制方法的影响而显得作用及疗效并不十 分明显.本研究证实片剂服用方便,可以增加给药量,作用效 果亦非常明显.人参养荣片(RSYRP)及其单味药对未注射环 磷酰胺(CY)的小鼠的细胞因子升高作用并不明显(见表1), 表明正常机体可以控制内源性细胞因子的产生,并维持自身 的平衡;注射外源G-CSF后,血液中G-CSF含量,IL一12,NK 细胞活性略有升高(P<0.05),而其他细胞因子(IL一1,IL一6, EPO)的变化不明显,或许与机体自身对细胞因子的调控,代 谢及注射剂量有关. CY作为一种化疗药物,因具有明显的杀伤肿瘤作用,在 肿瘤治疗中被广泛应用.本实验采用CY制作小鼠的化疗损 伤模型,显示其对机体免疫功能的损伤是多方面的,从细胞因 子角度分析,化疗可以阻抑多种细胞因子(IL一1,IL一6,IL一 12,EPO,G-CSF)的产生,同时降低NK细胞的杀伤活性.这 种负效应最终将导致化疗的难以维持.本实验显示,中药制 剂RSYRP对化疗所致的免疫损伤具有一定的调整作用,这种 调节作用是通过诱导多种内源性细胞因子的产生而实现的. 其可能的途径是:具有广泛调节作用的IL一1作为正向调节 的始动因子,促进造血干细胞由G期进入增殖周期并向造血 祖细胞分化,进而促进胸腺T细胞活化,增殖,分化,启动细 胞免疫阳];同时,IL-1诱导IL-6的产生,二者介导B细胞的 进一步分化,促进免疫球蛋白的合成,分泌及体液免疫功能 的增强.EPO,G-CSF参与造血细胞的分化,而IL一12的产生 可诱导增强NK细胞的杀伤活性及与杀伤活性相关的蛋白的 基因转录,诱导IFN-Y的产生,对Thl,Th2细胞的平衡具有 调节作用,参与免疫调节及抗肿瘤].因此,这种调节作用 具有宽泛性和平衡性.复方制剂RSYRP对化疗损伤小鼠细胞 因子的作用,并未表现为单味药作用量的明显累加,却表现为 总体的平衡,可能与机体自身具有的平衡机制有关,也可能与 复方中的其它成分有关.因为复方本身就有君,臣,佐,使 之间的互相协调或影响,其量的改变对药效有明显的影响,这 对机体免疫功能维持非常重要.对单味药的作用机制进行分 析比较可以看出,当归可以提高小鼠巨噬细胞培养上清中的 IL-1,血清中IL-1,IL一12的含量及NK细胞的活性,但对其 它细胞因子(EPO,G-CSF)的产生作用并不明显,提示其可能 以增强机体的非特异性免疫功能为主;人参可提高G-CSF, IL一12水平,并使NK细胞活性升高,提示其对造血细胞的分 化具有调整作用;而黄芪,白术使血清中IL一1,IL一6的含 量明显升高,提示其可能主要参与机体体液免疫功能的调 节.这与人参可改变应急状态下警戒期的病理改变,减轻胸 腺,淋巴组织的萎缩,以及黄芪促进脾脏抗体形成细胞生成, 白术促进IgG明显提高口基本一致.单独注射外源性G-CSF 时,化疗小鼠IL一12及NK细胞活性升高,但对其它细胞因子 的产生并无明显影响.其可能的机制是G-CSF可增加血液中 中性粒细胞数,使其活性增强,分泌GM—CSF,由此诱导树突 状细胞(DC)产生IL-12,进而增强NK细胞活性_8….同时说 明,外源性细胞因子6-CSF在启动机体细胞因子网络中的作 用并不十分明显. 参考文献: [1]王海燕,孙丰润,胡涛,等.人参养荣片对化疗损伤小鼠免疫功能的 调节[J].滨州医学院,1997,20(6):523. 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