镁离子抗氧化作用的实验研究_cropped

镁离子抗氧化作用的实验研究_cropped 镁离子抗氧化作用的实验研究 1 2 1 1孙设宗 , 毛达勇 , 卢方安 , 张红梅 1 2() 郧阳医学院 生化与免疫学综合实验室 , 附属太和医院检验部 ,湖北 十堰 442000 [摘 要 ] 目的 :探讨镁离子抗氧化作用的机制 。 : 3月龄昆明种小鼠 50只 ,随机分为正常对照组 、氧化对照 组 、不同浓度镁保护组 ,饲养 10 d后 ,腹腔注射 0. 15% CC l致小鼠肝损伤 ,将氧化对照组 、不同浓度镁保护组肝匀 4 浆中加入 FeSO和 HO,诱导自由基生成 ,观察镁离子在体内 、外的抗氧化作用 。结果 : 镁离子能显著降低小鼠血 4 2 2 清中 AL T和 A ST活性 ,以及肝细胞中脂质过氧化物 MDA 的含量 ; 体外实验镁离子对 MDA 生成有显著的抑制作 用 。结论 : 镁离子能抑制自由基的生成 ,促进自由基的清除 。 [关键词 ] 镁离子 ;抗氧化 ;小鼠 ;自由基 ( ) [文章编号 ] 1006 - 9674 2005 05 - 0260 - 03 [中图法分类号 ] Q582 [文献标识码 ] A 2 +1 2 The re sea rch of an t i - ox ida t ive m echan ism of M g SUN She - zong, MAO D a - yong, LU Fang - an, et a l 1 2 ( labora tory of biochem istry and imm unology, Yunyang M ed ica l College, S h iyan, H ubei 442000, Ch ina; D epa rtm en t of )C lin ica l labora tory, Ta ihe H ospita l, S h iyan, H ubei 442000, Ch ina 2 + A b stra c t: O b je c tive To exp lo re the an ti - oxida tive m echan ism of M g. M e tho d s F ifty Kunm ing m ice in 3 mon th s we re 2 + random ly d ivided in to con tro l group , oxida tion group and d iffe ren t leve l of M ggroup s. A fte r 10 days of b reed ing, a ll m ice we re in jec ted in trap e ritonea lly w ith 0. 15% CC l, hep a tic in ju ry wa s induced. To induce the p roduc tion of free rad ica l, Fe2 4 2 + SOand HOwe re added to the hep a tic homogena te of oxida tion group and d iffe ren t leve l of M g group. The an ti - oxida2 4 2 2 2 + tion of M gbo th in vivo and vitro wa s m ea su red. R e su lts The re wa s a sign ifican t reduc tion in se rum AL T and A ST ac tivity 2 + 2 + and MDA; the p roduc tion of MDA wa s inh ib ited m a rked ly byM gin vitro. C o n c lu s io n M gcan inh ib it the p roduc tion of free rad ica l and acce le ra te the c lea rance of free rad ica l. Key word s: m agne sium; an ti - oxida tion; mou se; free rad ica l 2 + M g作为体内重要的二价阳离子 ,是多种酶的 : ZS83 - 1 型内剂均为分析纯生化试剂 。仪器设备 () 切式组织匀浆机 浙西机械厂 , MD F - 382 E型超低 辅助因子 ,其作用近年来日益受到人们的关注 , 2 + [ 1 - 2 ] ( ) (温冰箱 Sony公司 , 752 型分光光度计 上海第二 表明 M g可以对抗自由基生成 ,对内皮细胞损 [ 3 ] ) 光 学 仪 器 厂 , Kone lab 60 i 全 自 动 生 化 分 析 仪 。本研究通过建立 CC l 诱导小鼠 伤有保护作用 4 ( ) ( Kone lab公司 , RA - 50 半自动生化分析仪 Tech2肝氧 化 损 伤 模 型 , 以 及 在 肝 匀 浆 中 加 入 FeSO和 4 [ 4 ] 2 + ) n icon公司 。HO,诱导自由基的生成 , 以探讨 M g 在体内 、 2 2 1. 2 方法外的抗氧化作用 ,为拓展镁离子的临床应用提供实 1. 2. 1 实验分组 : 50 只昆明种小鼠随机分 5 组 ,每 验依据和理论基础 。 组 10 只 。设 正 常 对 照 组 、氧 化 对 照 组 、21 mmo l / [ 5 ] [ 6 ] 1 材料和方法 L、42 mmo l /L、63 mmo l /L 镁保护组 , 各组均给 予正常饲料 ,正常对照组和氧化对照组自由饮水 ,不 1. 1 材料 同浓度的镁保护组 ,在饮水中分别以 M gSO的形式 4 28 ,昆明种 3月龄小鼠 50 只 ,雌雄各半 ,体重 加入 21 mmo l /L、42 mmo l /L、63 mmo l /L 浓度的镁 。36 g, 本 院 动 物 实 验 中 心 供 给 。 SOD、GSH、MAD、 饲养 10 d后 ,正常对照组腹腔注射豆油溶液 ,其余 () AL T、A ST试剂盒 南京建成生物公司 ,其它试 ( 各组腹腔 注射 0. 15 %的 CC l豆油 溶 液 10 m l / kg 4 [基金项目 ] 2005年度郧阳医学院中青年基金资助项 ) 体重 ,第 11 d禁食不禁水 24 h,于眼球取血 ,分离 ( ) 目 2005 ZQ Y02 血清备用 。 ( ) [作者简介 ] 孙设宗 1954 - ,男 ,湖北竹溪人 ,讲师 ,主要 1. 2. 2 血 清 AL T、A ST 活 性 测 定 : 用 速 率 法 测 从事生物化学的教学研究 。 AL T、A ST。 [ 4 ] 的抑制率 。 1. 2. 3 肝匀浆制备及 MDA、SOD、GSH 测定 : 处死 1. 3 数据处理小鼠后取出肝脏臵冰生理盐水中洗净血液 ,用滤纸 吸去水分称重 ,用 pH7. 4 的 PB S按 1 ?10 稀释冰浴 SPSS10. 0软件用方差分析处理 。下匀浆 , 4 ? 4 000 r /m in 离心 5 m in。取上清用双 2 结果 缩脲法测肝匀浆中蛋白质含量 ,用 pH7. 4 的 PB S稀 2 + ) (释成 4 m g蛋 白 /m l备 用 。测 MDA 丙 二 醛 、SOD 2. 1 M g对 CC l 肝损伤小鼠血清 AL T、A ST含 4 () )(超氧化物岐化酶 、GSH 谷胱甘肽 的含量 。 ()的影响 表 1 2 + 1. 2. 4 M g对体外诱导肝脂质过氧化抑制作用的 CC l 进入机体后由肝微粒体细胞色素 P 代 4 450 ( ) 测定 : 取上述各组肝 匀浆 4 m g蛋 白 /m l0. 25 m l ( ) 生成三氯甲基自由基 〃CC l,攻击肝细胞膜上 3 臵相应 的 试管 中 , 除正 常对 照 组外 , 其 余各 组 加 6 脂分子中不饱和脂肪酸产生脂质过氧化物 ,从而 μμmmo l /L FeSO50 l, 10 mmo l /L HO50 l, pH7. 4 4 2 2 伤细胞膜 ,导致 AL T、A ST漏出细胞 ,引起血清中 μ的 PB S缓冲液 500 l,正常对照组加 PB S补充容量 活性升高 。氧化对照组与正常对照组比较 ,能显 至等量 。各管臵 37 ?水浴中保温 25 m in启动反应 ( ) 升高 AL T和 A ST P < 0. 01 ,不同浓度的镁离子 产生脂质过氧化物 ,加 15 %的三氯醋酸 1. 5 m l结束 护组与 氧 化 对 照 组 比 较 可 显 著 性 的 降 低 血 清 反应 , 0. 67 %的硫代巴比妥酸溶液 1. 5 m l,臵沸水中 ( ) AL T、A ST的含量 P < 0. 01 ,说明镁离子对自由 20 m in 取 出 , 冷 却 后 离 心 用 752 分 光 光 度 计 检 测引起的肝损伤有保护作用 。 [ 4 ] Anm 处的吸光度值 ,以 A反映 MDA 的含量 。 532 532 按公式计算镁离子对脂质过氧化物 ———MDA 产生 2 + ( )表 1 M g对 CC l 肝损伤小鼠血清 AL T、A ST含量的影响 x ?s 4 - 1 - 1 ( )( )组别n AL T活性 u〃L A ST活性 u〃L 正常对照组10 30. 37 ?17. 4583. 87 ?19. 54 ?? 10 氧化对照组271. 57 ?61. 15230. 08 ?45. 0933 10 63 mmo l /L 镁保护组 163. 12 ?59. 63142. 16 ?29. 3133 10 42 mmo l /L 镁保护组 101. 00 ?45. 41107. 23 ?32. 8133 10 21 mmo l /L 镁保护组 153. 35 ?77. 17123. 81 ?26. 64 ? 3 注 :与正常对照组比较 P 0. 01;与氧化对照组比较 P 0. 01。 • • 2 + 2 + CC l 肝损 伤 MDA、GSH、SOD 的2. 2 M g对小鼠 M g与 氧 化 对 照 组 比 较 , 可 显 著 降 种浓 度 的 4 () ( ) 影响 表 2 MDA 的含量 P 0. 01 ,但体内清除自由基的主 • ( 氧化对照组与其它各组比较 MDA 显著升高 P成分 SOD 和 GSH 并没明显的变化 ,实验提示急性 2 + ) • 0. 01 ,说明 CC l进入体内产生三氯甲基自由基损伤时 , M g 抗氧化作用也可能通过非酶性途径 4 ( ) 〃 CC l, 后 者 攻 击 细 胞 膜 产 生 脂 质 过 氧 化 物抗自由基的生成或清除 。3 () L PO ,导致 L PO 的代 谢 产物 MDA 显 著升 高 。三 2 + ( )M g对小鼠 CC l 肝损伤 MDA、GSH、SOD 含量的影响 x ?s 表 2 4 - 1 - 1 n )( ()( )组别MDA nmo l〃m g〃p ro GSH m g GSH 〃gp ro SOD u〃gp ro 正常对照组10 5. 146 ?1. 5032. 71 ?7. 52?47. 33142. 71 ? 10 氧化对照组 34. 8 ?6. 08158. 93 ?42. 049. 25 ?2. 743 10 63 mmo l /L 镁保护组 36. 36 ?6. 79162. 52 ?39. 625. 89 ?1. 66310 42 mmo l /L 镁保护组 29. 62 ?9. 33151. 75 ?54. 355. 29 ?1. 963 10 21 mmo l /L 镁保护组 26. 95 ?5. 19137. 22 ?45. 445. 92 ?0. 99 ? 3 注 :与正常对照组比较 P < 0. 01 ,与病理造模组比较 P < 0. 01。 2 + ( ) 2. 3 M g对体外诱导肝脂质过氧化物抑制作用的 0. 359 ,说明诱导肝匀浆脂质过 高于空白对照组 2 + () 测定 表 3 化是成功的 ,饮水中加入不同浓度的 M g的小鼠 将上述肝匀浆在试管中加入 6 mmo l /L FeSO50 匀浆 ,与氧化对照组比较可明显的抑制脂质过氧 4 μμl, 10 mmo l /L HO50 l, 在保温过程中可诱导脂 物的生成 , A显著降低 ,证明镁离子可对抗自由基 2 2 532 2 + 质过氧化物的生成 ,氧化对照组 A为 0. 697 ,明显 抑制脂质过氧化物的生成 。不同浓度的 M g抑 532 表 3 镁离子对体外诱导脂质过氧化物给小鼠 饮 水 中 加 入 21 mmo l /L、42 mmo l /L、63 2 + 2 + ( )mmo l /L M g,与氧化对照组比较 ,各浓度的 M g均 产生的抑制作用 x ?s ( )具有显著性 P 0. 01 的抗氧化作用 ,但不同浓度 • 加镁浓度 A( )n 抑制率 % 532 () mmo l /L 之间抗氧化作用强度存在一定的差异 ; 体外抗氧化 2 + 空白对照组10 0. 359 ?0. 056 作用证明 ,不同浓度的 M g对脂质过氧化产物 ——— 氧化对照组10 0. 697 ?0. 071MDA 生成 的 抑 制 率 , 分 别 为 54. 5 % 、70. 38 % 、47. 10 63 54. 50 0. 317 ?0. 0832 + 65 % , 提 示 M g 抗 氧 化 作 用 与 浓 度 有 关 , 以 42 10 42 70. 38 饮水加镁组0. 204 ?0. 038 2 + mmo l /L M g 浓 度 的 抗 氧 作 用 最 强 。可 能 是 由 于 10 21 47. 65 0. 365 ?0. 1362 + 2 + M g 浓度过低 ,不能有效的拮抗 Ca 和对抗自由基 注 :抑制率计算方法按文献 [ 4 ]。 2 + 的生成 , M g浓度过高改变细胞内的二价阳离子的 [ 3 ] 2 + 3 讨论 平衡 ,过度抑制了钙通道 和 Ca的作用 , 抗氧化 作用反而减弱 。 用 CC l诱导小鼠实验性肝损伤是经典的实验 4 方法 , 目 前 认 为 , CC l诱 导 肝 损 伤 的 机 制 , 主 要 是4 [参 考 文 CC l经肝细胞微粒体内细胞色素 P代谢裂解生成4 450献 ] 〃CC l。在 〃CC l启动的脂质过氧化连锁反应中 ,3 3 [ 1 ] 时安云 ,徐 海 . 镁对缺血心肌的保护作用 [ J ]. 中国 - ()可产生毒性更强的超氧阴离子自由基 O和羟自 2 ( ) 病理生理杂志 , 1996, 12 2: 126 - 129.() 由基 OH 〃,这些在体内产生的自由基可攻击膜磷 [ 2 ] Ga rc ia LA , D e jong SC, M a rtin SM , et a l. M agne sium 脂中不饱和脂肪酸 ,产生脂质过氧化作用而损伤线 reduce s free rad ica ls in an in vivo co rona ry occ lu sion - 粒体膜和 肝 细 胞 膜 , 导 致 细 胞 中 AL T、A ST 逸 出 细 ( ) rep e rfu sion mode l[ J ]. J Am Co ll Ca rd io l, 1998 , 32 2 : 536 - 539. 胞 ;在肝 匀 浆 中 加 入 FeSO和 HO, HO是 活 性4 2 2 2 2 2 + 氧 ,如遇 Fe则可诱导 产 生羟 自由 基 , 攻 击不 饱和 [ 3 ] 李 健 ,董果雄 ,张社华 . 镁对血管内 皮细胞缺氧再 脂肪酸产生脂质过氧化物 。MDA 作为自由基与生 ( ) 复氧损伤的保护作用 [ J ]. 中国微循环 , 2003 , 7 4 : 物膜不饱 和 脂肪 酸发 生 脂质 过氧 化反 应 的 代 谢 产 227 - 229. [ 7 - 8 ] 物 ,其含量可反映自由基的变化和膜损伤程度 。 [ 4 ] 杨建雄 ,原江峰 ,李发荣 . 柿叶黄酮的抗氧化作用的研 2 + 本实验表明 , 给小鼠饮水中加入 M g, 可显著 降低( ) 究 [ J ]. 营养学报 , 2003, 25 2: 215 - 217. 血清中 AL T、A ST的含量 ,抑制脂质过氧化物的 生成 ,李俊杰 ,张照英 . 镁抗动脉粥样硬化的进展 [ J ]. 微量 [ 5 ] 降低肝匀浆中 MAD 含量 。在体外抗氧化实验 ( ) 元素与健康研究 , 2003 , 4 , 20 2 : 49 - 51. [ 6 ] 王福弟 ,和 红 ,李生广 ,等 . 镁对大鼠实验性动脉粥2 + 中直接在氧化对照组和 M g保护组加入 FeSO 和 样硬化形 成 的 防 护 作 用 [ J ]. 第 二 军 医 大 学 学 报 ,4 ( ) 1997, 18 3: 128 - 130. HO,诱导产生羟自由基 ,攻击不饱和脂肪酸产生脂 2 2 2 + 质过氧 化 物 , M g保 护 组 对 脂 质 过 氧 化 代 谢 产 Traystm an RJ , Kirsch JR , Koeh le r RC. O xygen rad ica l [ 7 ] 物 ———MDA 的生成有显著的抑制作用 ; 可阻止脂质 m echan ism s of b ra in in ju ry fo llow ing ischem ia and rep e r2 过氧化物的生成 ,对自由基损伤有保护作用 。但是 , ( ) fu sion [ J ]. J App l Physio l, 1991, 71 4: 1 185 - 1 195. 2 + M g并不一定能增加 SOD 和 GSH 的含量 , 其抗氧 [ 8 ] 张 敏 ,王爱武 ,王秀云 . 尼莫地平对 大鼠急性脑缺 2 + 化作用并不完全依赖于 SOD 途径 。M g抗氧化作 血再灌 注 损 伤 的 保 护 作 用 [ J ]. 中 国 药 师 , 2003 , 6 2 + 用的可能机 制是 : M g是 钙离 子的 天 然拮 抗剂 , 可 ( ) 4 : 201 - 202. 减少跨膜钙离子内流 ,降低了细胞内钙超载 ,对膜起 [收稿日期 ] 2005 - 04 - 052 + 保护作用 ; M g能抑制尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷