血浆载脂蛋白ApoAI的分离纯化.doc

血浆载脂蛋白ApoAI的分离纯化.doc 血浆载脂蛋白A-I(ApoA-I)的分离纯化 [目的与要求] 掌握并提高生化实验基本原理及技术;了解生物大分子分离的设计及路径;培养生物化学领域的科研设计的能力。 [原理] 生物大分子主要是指蛋白质、酶、多糖和核酸。迄今已知的生物大分子的分离纯化方法很多，主要利用它们之间特异性的差异，如分子量大小、分子形状、酸碱性、溶解度、极性、电荷和对其它分子的亲和力等建立起来的。其主要原理基本可归纳为两个方面，一是利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两相或多相中，如盐析、盐溶、有机溶剂沉淀、共沉淀、层析和结晶等;二是将混合物置于单一的物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心、超滤等。目前纯化蛋白质的3种关键方法是电泳、超速离心和层析。由于生物大分子不能加热熔化、汽化，所能分配的物相只限于固相和液相、并在这两相之间交替进行分离纯化。因此，可将生物大分子制备方法按分子大小和形状、带电性质、溶解度、酸碱性、对其它分子的亲和力等主要因素分类(见下表)。 性质 具体方法 分子大小和形状 差速离心、超滤、分子筛、透析 溶解度 盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等 电荷差异 电泳、等电聚焦、离子交换层析、吸附层析 生物功能专一性 亲和层析、疏水层析、共价层析 在实际工作中，往往综合使用上述几种方法才能制备出一种纯化的生物大分子。 分离纯化生物大分子总希望纯度好、产率高，但实际上，两者不能兼得。因此考虑分离纯化条件和方法时，不得不在两者间作适当的选择。一般，科研上更多考虑纯度，工业生产上更多选择产率。 在进行实践前，应进行充分的调查研究，查阅有关文献资料，对自己欲分离纯化的物质的物理、化学及生物学性质先有一定的了解，然后进行实验工作。对于一个未知的生物大分子试样进行创造性的分离纯化时，首先要确定研究的主要目的。如分离纯化肽类物质或酶类等，可参考已有的肽类或酶类物质分离纯化方法进行反复的摸索比较，找到一些工作规律，逐步达到预期的结果。在分离纯化工作中，另一重要工作是建立相应的分析鉴定方法及生物活性测定方法，即对目的活性物质跟踪分析，以便正确指导分离纯化工作一步步顺利深入进行，若要提纯一生物大分子达到一定纯度，一般要经过多种方法、步骤和不断变化操作条件才能达到目的，因此，整个实验过程中，各种方法的优劣，选择条件其效果的好坏，均需通过分析鉴定和生物活性测定来判断。 生物大分子一般需经过下列步骤(或其中几个步骤)才能分离纯化达到所需的要求。 一、前处理 包括生物的选择及处理、细胞破碎、细胞器分离及目的物提取。 选材主要根据实验目的而定，从工业生产角度选材，注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物材料原料。科研角度选材，则只需符合实验预定目标的要求即可。材料选定后，必须尽可能保持新鲜，尽快加工处理。如不立即进行实验或加工，则应冷冻保存。 若材料是提取液、体液(如血)、代谢排出液(如尿)、细胞外某些多肽激素、蛋白质、酶等则不需破碎细胞。若为细胞内生物活性物质则需细胞破碎，如科研上材料处理量少，则可用匀浆器或超声波处理法破碎;若处理材料量较大，则可用高速组织捣碎机。操作时，将 调速器拨至所需速度档次，每次捣碎时间为5s，间歇30s，共捣碎5-6次。另外，破碎细菌细胞常用方法还有与石英砂研磨、高压挤压、交替冻融法或酶消化法等。 若目标物是分布在各种细胞器上的各类核酸或蛋白质，则尚需分离相应的细胞器。一般采用差速离心法。 经上述方法预处理的材料，需置于一定条件下和溶剂中，以提取目的生物大分子，使其以溶解状态充分的释放出来，并尽可能保持原来的天然状态，不丢失生物活性。影响提取率的重要因素主要取决于提取物质在某一溶剂中的溶解度、由固相扩散到液相的难易、溶剂pH值及提取时间。一般的说，生物大分子提取时间愈长，溶解度愈大，则生物活性愈易丢失，同时杂质溶解度也增大，故提取的最佳条件的选择，必须综合分析各种影响因素，合理地搭配各种提取条件。 二、粗制分离 包括提取液浓缩和目的物的粗制 当生物大分子提取液获得后，选用一套适当方法，将所要的目的物与其他大分子分离开来，一般，这一步如蛋白质和酶粗制时，主要用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂分级分离法等。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。但分辨率低。 RNA和DNA的粗制用稀碱法、浓盐法、苯酚法等分级分离方法。 除此之外，有时粗制分离或精制分离前尚需用聚乙二醇吸收法、减压薄膜浓缩或超滤法等方法进行浓缩。 三、精制分离 一般样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分已被除去，进一步提纯，通常使用柱层析法，包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、金属螯合层析、共价层析、疏水层析以及亲和层析等。有时还可选择梯度离心、电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的提纯步骤。用于精制的方法，一般规模较小，但分辨率高。 凝胶电泳，也可用来制备不同构象的DNA、不同大小的DNA片段(或RNA片段)及蛋白质、肽等。这方法一般规模较小，但分辨率高。 值得特别指出的是层析介质的合理搭配。工业生产、医药工业和科研上，往往需要制备各种纯度的生物活性物质。在分离制备这些生物活性物质的过程中，需要采用各种层析技术，这就有各种层析介质及层析技术的合理搭配问题。方法选择适当，将达到预期效果，若选择不当，将导致失败，或得到低活性、低收率的产品。这里以纯化尿激酶(简称UK)为例，简单说明选择的一般原则。首先应尽可能想办法了解UK的分子量、等电点、溶解性及稳定性等基本性质。精制时，一般将粗品第一次上柱，用亲和层析法(或离子交换层析)较好，此法专一性强，纯化倍数高。如分离UK先用苯甲醚-Sepharose-4B(纯化18倍)，再用Sephadex G100(纯化倍数4倍)得到UK的比活高达12.7万IU/mg蛋白，这是国内外比活最高的产品。如用文献报道的方法，最后一步采用亲和层析法，对高分子量和低分子量的酶均有亲和性而不能分开。这是UK纯化科研过程的介质选择。若是工业生产，就不能完全用这种方法。工业生产上，UK产品活性达3万IU/mg蛋白，就可制成针剂，故一般从第一级粗品(硫酸铵盐析物)开始纯化，其粗品活性200-600IU/mg蛋白，上CM-Sephadex C得UK比活性为5010000IU/mg蛋白;第二次可用亲和柱(苯甲醚-Sepharose 4B)或金属螯合层析，得UK比活性3-4万IU/mg蛋白。工业上不能选择Sephadex G100，因为分子筛凝胶介质的上样量一般只有离子交换树脂的约千分之一，不适用于工业规模生产。 另一个值得特别指出的问题，是洗脱pH值的合理选择问题，一般条件下，碱性蛋白或碱性酶、肽在酸性条件下较碱性条件稳定，反之亦然;所以在操作过程中，对碱性蛋白或碱性酶、肽等尽量使用酸性条件，尽可能避免碱性条件。对酸性蛋白、酶等，在碱性条件下较稳定，所以尽可能采用碱性条件。 四、结晶 结晶是蛋白质分离的最后步骤。蛋白质和酶的结晶影响因素和条件如下: 1. 纯度 蛋白质纯度愈高，就愈容易结晶。大多数生物大分子第一次得到结晶后，仍可以进行多次重结晶，每次重结晶纯度均有一定提高，直至恒定为止。 2. 浓度 溶液愈浓，就愈容易结晶，若在过饱和的溶液中结晶，杂质含量多，且晶形也不好，故样品浓缩至一定浓度或所得沉淀溶解至合适浓度后，缓慢地加入盐溶液或有机溶剂至呈现微弱浑浊或略处于过饱和状态，然后放置在一定温度下，待其静止地、慢慢地析出结晶，此时才酌情补充加入少量的盐或有机溶剂使其结晶完全。如加入的盐或溶剂过多，沉淀出来的不是晶体，可逐滴加入蒸馏水或对水透析，促使沉淀转化为结晶。 3. pH值 结晶的溶液pH值一般选择在被结晶的蛋白质或酶的等电点处，可有利于晶体的析出。 4(温度 低温条件下，蛋白质和酶不仅溶解度低，而且不易变性失活。因此有利于这些物质结晶。温度可在4-10?范围内选择。 5(晶种 蛋白质和酶不易结晶，如胰岛素往往加入少量胰岛素晶体可导致大量结晶的形成，有时用璃棒轻轻刮擦容器壁也可以达到此目的。 五、干燥和样品保存 生物大分子的制备得到所需的产品后，为了防止变质、保持生物活性、易于保存和运输，常常要干燥处理，最常用的方法是真空干燥和冷冻干燥，某些无活性核酸、微生物酶制剂和酪蛋白等工业产品则较多地应用喷雾干燥、气流干燥等直接干燥法。 保存方法与生物大分子稳定性及保持生物活性的关系很大，生物大分子的保存可分为干粉和液态两种。但不论是干粉或液态都应避免长期暴露于空气中防止微生物的污染。温度对生物大分子的稳定性和生物活性影响很大，故一般生物大分子物质都在低温(0-4?)保存，保存时间也不宜过长，否则，会招致样品的变质或失活。 干粉保存的制品一般比较稳定，如制品含水量很低，在低温情况下，生物大分子活性可在数个月甚至数年没有显著变化。储藏方法也很简单，只将干燥后的样品置于干燥器内(内装有干燥剂)密封，在0-4?冰箱中保存即可。有时为了取样方便和避免取样时样品吸水和污染，可先将样品分装成许多小瓶，每次用时，只取出一小瓶。 液态保存对保持生物大分子活性是不利的，故只在一些特殊情况下采用，并需要严格的防腐保护措施，保存时间也不宜过长，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵、蔗糖、甘油等，某些金属离子如钙、镁、锌等对某些酶也有一定的保护作用。 在生物大分子分离提纯的过程中，经常需要测定某一大分子的含量和某一大分子的提纯程度(即跟踪分析)。这些分析工作还包括鉴定最后制品的纯度。 生物大分子含量的测定是一项复杂而重要的工作，除采用通用方法外，还常用特异的方法，无法逐一介绍，这里仅作一般性方法介绍。 测定多糖总量常用的方法有:菲林试剂法、蒽酮法、旋光法等。测定蛋白质和酶总量常用的方法有:凯氏定氮法、双缩脲、Folin-酚试剂法、Biored染色测定法、紫外吸收法等。 测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量通常要用具有高度特异性的生物学方法。具有酶或激素性质的蛋白质可以利用它们的酶活性或激素活性来测定含量;利用抗体-抗原反应，也可测定某一特定蛋白质的含量。这些生物学方法的测定和总蛋白质测定配合，可以用来研究蛋白质分离纯化过程中，某一特定蛋白质的提纯程度。蛋白质纯度常用某一特定成分与总蛋白之比来表示。科研中要一直进行到这个比值不再增加为止，即达到纯;工业上提纯工作进行到这个比值符合产品规格为止。 测定核酸总量常用的方法有:定磷法测定RNA或DNA，二苯胺法测定DNA，地衣酚法(改 良法)测定RNA，紫外吸收法等。 上述生物大分子含量测定法，在工业生产中，也常常用作纯度测定法。在科研上纯度鉴定是分离纯化过程中每一步必不可少的一项工作，其目的不仅研究产品纯度，而且也了解所采用纯化方法的优劣，指导研究工作深入进行。 蛋白质和酶制品纯度的鉴定通常采用的物理化学方法有:SDS电泳法、等电聚焦电泳法、N-末端氨基酸残基分析、高效液相柱层析、沉降分析、扩散分析等。选用任何单独一种鉴定法都不能确定蛋白质的纯度，必须同时采用2-3种不同的纯度鉴定法才能确定。 核酸的纯度鉴定通常采用物理的方法，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳、沉降分析和紫外吸收法，即在pH7时，测定样品在260nm与280nm的光吸收值，从A/A的比值即260280可判断样品的纯度。核酸样品还可以进行生物活性测定，如测定mRNA体外翻译活性，用于了解核酸在纯化过程中的提纯程度。 同理，若选用任何单独一种鉴定法也不能确定核酸的纯度，必须同时采用2-3种不同的纯度鉴定法才能确定。 载脂蛋白A-I的血浆浓度大约在1.17-1.72g/L范围，在血浆中主要存在于HDL中，也少量存在于CM和VLDL，其中HDL中蛋白质部分的70%是apoA-I。本实验以正常人新鲜血浆为分离材料，通过序列超速离心分离富含apoA-I的HDL，经聚乙二醇吸收浓缩、透析脱盐和乙醚/乙醇脱脂得到apoA-I的粗制品，再经DEAE-Sepharose FF柱层析分离纯化可得到apoA-I纯品。通过SDS-PAGE和琼脂糖免疫双扩散鉴定后，合并已纯化部分apoA-I洗脱液，并透析、浓缩。再经Folin-酚试剂法定蛋白质浓度后，可-20?液态保存或冷冻干燥后干粉保存。 [操作步骤] 1. 血浆分离及预处理 取献血员全血400mL，EDTANa抗凝，1000×g离心15min，分离血浆。根据血浆体积，2 加入0.015%的苯甲基氟磺酰(PMSF)，防止脂蛋白变性。 2. apoA-I粗制分离 (1) 固定角度转头序列超速离心分离血浆HDL 血浆中加入适量的NaBr，调节 密度至1.060g/mL，分置于离心管(38.5ml/管)中，加盖，用1.060g/ml密度液平衡，放入60Ti转头，在10?下40，000rpm(170，000×g)离心24小时。CM、VLDL、LDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取，保存作其它用途。下层溶液中加入适量的NaBr，调节密度至1.21g/mL，分置于离心管中，加盖，用1.21g/mL密度液平衡，放入60Ti转头，在10?下50，000rpm(280，000×g)离心24小时。HDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。 (2)HDL脱脂及apoA-I粗品制备 将HDL用注射器加入50倍体积，-20?预冷的无水乙醇?无水乙醚(3?1)脱脂液中，脱脂过夜，共处理3次。在搅拌下，用氮气轻轻吹干，所得干粉即apoA-I粗品。 3. apoA-I精制分离 DEAE-Sepharose FF柱层析分离apoA-I 将脱脂样品溶于20mM Tris-HCl(pH8.2) /6M尿素溶液中，然后上20mM Tris-HCl(pH8.2)/6M尿素溶液预平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用500mL线性梯度(0 - 300mM NaCl)盐溶液以1mL/min流速进行洗脱，紫外 器280nm检测，部分收集器收集流出液，每管2ml。 4. 鉴定 (1)SDS-PAGE鉴定 取各峰的峰顶及前后1/2峰高管洗脱液进行SDS-PAGE电泳鉴 定，方法参阅实验十九，其中第三峰仅在对应于LMW28，000处可见一蛋白条带，证明第三峰是分子量为28，000的纯蛋白质。 (2)琼脂糖免疫双扩散鉴定 以0.1M 巴比妥缓冲液(0.05μ，pH8.6)为溶剂制备 1%琼脂糖凝胶，用微波炉加热融化，倒入专用扩散板或玻璃平皿中，冷凝后打孔。中间一孔，周围六孔，打多组孔。中间孔分别加入各峰的峰顶及前后1/2峰高管洗脱液10-20μL，周边孔加入apoB-100、A-I、C-?、E、白蛋白等抗血清，置37?培养箱24小时，观察沉淀线，可见第三峰只与apoA-I抗血清有清晰沉淀线，与其它抗血清无免疫沉淀反应。 综合两种鉴定结果，证明第三峰为纯化的apoA-I。 5. 透析与浓缩 合并第三峰各管，装入透析袋。4?，在1mM的碳酸氢铵中透析过夜。再4?，40%PEG20000浓缩至适当体积。 6. 定量与保存 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量，方法参阅实验3。然后分装，冷冻干燥保存或-20?保存。 [试剂] 1( EDTANa 2 2( 苯甲基氟磺酰(PMSF) 3( NaBr 4( 密度液:以NaBr与双蒸水配制，以比重计测定密度。配制成1)1.060g/mL;2) 1.210g/ml 两种密度液。 5(0.01M PBS(pH7.4) 6(40%PEG20000 7(脱脂液:无水乙醇?无水乙醚(3?1)，-20?预冷。 8( 洗脱液: A液:20mM Tris-HCl(pH8.2)/6M尿素;B液:20mM Tris-HCl(pH8.2)/300mM NaCl/6M尿素。 9( DEAE-Sepharose FF柱:取Pharmacia公司的DEAE-Sepharose FF凝胶120mL，加 #入双蒸水500mL，搅拌后倒入3砂芯漏斗中减压抽干。转入500mL烧杯，加双蒸水200mL，搅拌，任其自然沉降。置于真空干燥器中200mmHg柱减压30min，以除去凝胶中的空气。装入LKB层析柱(1.6×60cm)中，用洗脱液A液平衡3-5个柱体积(400-600mL)。 10(SDS-PAGE电泳试剂 参阅实验十九 11(0.1M 巴比妥缓冲液(0.05μ，pH8.6) 12(1%琼脂糖: 1g琼脂糖加入100mL pH8.2的0.05M Tris-HCl缓冲液，加热至微沸，待琼脂糖溶化后双蒸水补至100mL。 13(低分子量(LMW): Pharmacia。 14(抗血清:ApoB-100、A-I、C-?、E和apo(a)以及人白蛋白抗血清，自制或奥地利Graz大学赠送。 [器材] 1( 标准液相层析系统 Pharmacia; 2. 比重计1.000-1.100g/mL，1.100-1.200g/mL; 3(聚碳酸酯厚壁离心管，Beckman; 4. 角度转头 60Ti，Beckman; 5(超速离心机 Beckman LM-80; 6. 离心机; 7. 电泳仪; 8(冷冻干燥机; 9. 电泳槽; 10. 烧杯、量筒等。