【doc】人脐血单个核细胞体外扩增后植入NOD／SCID小鼠重建多系造血

【doc】人脐血单个核细胞体外扩增后植入NOD／SCID小鼠重建多系造血 人脐血单个核细胞体外扩增后植入NOD, SCID小鼠重建多系造血 中华器官移植杂志2006年4月第27卷第4期ChinJOrganTransplant,Apr20O6.Vo1.27,No.4 人脐血单个核细胞体外扩增后植人 NOD/SCID小鼠重建多系造血 毛平彭盘俐许力 【摘要】目的探讨人脐血单个核细胞(MNC)体外扩增后植入能力的改变,以及对NOD/SCID 小鼠造血重建的影响.方法采用不同细胞因子组合对人脐血MNC进行短期无血清培养扩增,比 较扩增后的效果及细胞凋亡的变化;将扩增6d后的人脐血MNC植入经半致死剂量照射的NOD/ SCID小鼠体内,观察小鼠6周后的存活率和造血重建情况.结果人脐血MNC在干细胞因子 (SCF),酪氨酸激酶受体3配基(FL),白细胞介素6(II,6)和白细胞介素3(IL-3)细胞因子共同作用 下,培养6,10d获得最佳扩增效果,同时细胞面膜联蛋白V(AnnxinV)的表达明显减少;移植6 周后有55.6的小鼠存活,存活小鼠的骨髓,脾和胸腺细胞中均能出人类CIN5,CD34,CD33, CD3和CD19抗原,外周血提取的DNA可检测出人特异的Cart—I基因和Alu基因.结论SCF+ FI+II6+II,3细胞因子协同作用能有效扩增人脐血MNC,MNC扩增6d后可成功植入N()D/ SCID小鼠体内,并帮助小鼠重建多系造血. 【关键词】脐血干细胞移植;人类;小鼠 ImplantationofexvivoexoandedhumancordbloodmononuclearcellsintoN0D/SCIDmice0 Ping,PENGPan— li,xULi.DepartmentofHematology,InternalMedicineofAffiliatedGuan— gzhouFirstMunicipalPeople'SHospita1.GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou51()18(1,China [Abstract]ObjectiveToelucidatetheeffectofexvivoexpansionofumbilicalcordblood (UCB)mononuclearcells(MNCs)ontheirimplantationcapabilityandthehematopoieticreconstitu tion,andtofindafeasiblewayofapplyingexvivoexpandedUCBMNCstoclinicaltransplantatiorL MethodsUCBMNCswereculturedinshort— terminserum-freemediumwithdifferentearlyacting cytokinescombinationsinordertoobservetheamplificationresultandcellsapoptoticdifference.The 6-dayexpandedcellsweretransplantedintosublethallyirradiatedN()D/SCIDmicetoassesstheim— plantationandthehematopoieticreconstitutionofthesurvivalmice.ResultsUCBMNCsreachedthe bestamplificationresultbetweenday6andday10withthecontributionofSCF.FI,IL6andI3in commonandthepresenceofAnnxinVonthesurfaceofcellsobviouslydecreased.Sixweeksafter transplantation,CI)45,CD34,CD33,CD3andCD19antigencouldbedetectedbvFCMonBM, spleenandthymuscellsofthealivemiceandthehumanspecificAluandCartIrepetitivesequence couldbedetectedintheDNAobtainedfromperipheralbloodbyPCR.ConclusionAfter6dayeffec— tiveexpandingwithSCF+FI+II.6+IL3UCBMNCscanbeimplantedintoN()D/SCIDmiceS UC cessfullyandcontributetoreconstitutethemultiplehematopoiesis. [Keywords]Cordbloodstemcelltransplantation;Humans;Mice 人脐血移植在临床上广泛地应用于血液病和急 性辐射损伤等患者的造血重建,但单份脐血中所含 的造血细胞数往往只能用于儿童或低体重成人患 者_1j,而采用脐血体外扩增的方法可克服这一障 碍_2j,脐血体外扩增常用分离纯化的CD34或其亚 群细胞作为起始培养细胞,但临床上脐血的保存, 基金项目:广东省科技计划基金资助项目(133O2O2);广州市科学技术局 科技攻关重点项目基金资助项目(2002z2D1241) 作者单位:51Ol811广州医学院附属广州市第一人民医院血液内科;通讯 作者:彭盘俐(Email:liziepan@yahoo.corn.cn) ? 231? 输注或移植多采用分离的单个核细胞(MNC)或全 血细胞,我们曾经证实过以脐血MNC为起始培养 细胞不仅能减少细胞损失,简化实验操作,而且能够 实现有效的扩增一].因此,我们继续探讨人脐血 MNC扩增后植入动物的情况,尝试寻找一套人脐 血扩增后应用于临床移植的完整可行. 材料和方法 1.脐血的来源:脐血取自足月正常分娩的健康 产妇,由广州医学院附属广州市第一人民医院妇产 ?232?中华器官移植杂志2006年4月第27卷第4期ChinJOrganTransplant,Apr2006,Vo1.27No.4 科和广东省人民医院妇产科提供.每例采集脐血 6【),11(1ml,ACD-A抗凝,共采集8例. 2.主要细胞因子与实验试剂:羟乙基淀粉液 (HES)购自美国B.Braun公司.人淋巴细胞分离 液(Ficoll—Hypaque)购白天津灏洋生物公司.干细 胞因子(SCF),酪氨酸激酶受体3类配基(FL),白 细胞介素3(IL一3)和白细胞介素6(IL一6)均购自英 国PeproTech公司,溶解后在一2()?保存备用.无 血清培养基使用StemSpanSFEM,造血祖细胞半固 体集落培养基使用MethoCultGFH4434,均购自 .CD34一FITC, 加拿大StemCellTechnologies公司 CD38一PE,CD45一APC,CD33一FITC,CD3一PE,CD19一 FITC单抗和羊抗鼠IgG-FITC均为BDPharmin— gen公司制品.膜联蛋白V(AnnexinV)试剂盒购 自BenderMedsystems公司.DNA抽提试剂盒为 TexasBiogene公司产品.Cart一工基因,Alu基因和 actine基因引物由上海博亚生物科技公司合成. X射线照射源由广州市肿瘤医院放疗中心提供. 3.实验动物:取6,8周龄NOD/SCID小鼠36 只,雌雄不限,购自中山大学实验动物中心,均置于 无特定病原体(SPF)环境饲养. 4.MNC的分离与液体悬浮培养:脐血采集6h 内,用本实验室HES联合Ficoll—Hypaque密度梯 度离心法_4]提取MNC,按1×10个/ml的密度接种 于含无血清培养基的5()ml培养瓶中,并加入青霉 素(100U/m1),链霉素(100ug/m1)及细胞因子,在 体积分数为5的CO,37?及饱和湿度的条件下 连续培养14d,在第6和10d半量换液.按不同细 胞因子的组合分为3组:A组:空白对照,不加任何 细胞因子;B组:加入SCF50mg/L+FL50mg/L +IL一620mg/I;C组:力口入SCF50mg/I+FI5() mg/L+II一620mg/I+II一320mg/I.分别在培 养的第0,6,1()和14d取出少量细胞用于计数,检测 CD34,CD3438一细胞百分含量,培养集落形成单 位(CFU)和多向祖细胞集落(CFU—GEMM)数. 5.造血祖细胞集落培养:将细胞按2×10个/ ml接种到24孑L板甲基纤维素半固体培养基中,每 份复种1孑L,每孔0.5ml,置于体积分数为5的 CO,37?及饱和湿度的培养箱中培养14d,计数 CFU,培养至21d时,计数CFU—GEMM.倒置显 微镜下观察,将>5O个细胞的细胞团计数为1个集 落,CFU—GEMM为至少包含两系的混合集落. 6.凋亡标记AnnexinV的检测:严格按An— nexinV试剂盒说明书操作处理5×10个MNC,流 式细胞仪检测凋亡细胞的百分率. 7.NOD/SCID小鼠移植人脐血细胞:36只 N0D/SCID小鼠给予250cGy的半致死剂量的X 射线照射(6mVX射线加速器),照射率30()cGy/ min,照射后4h内从尾静脉注入200l生理盐水或 MNC悬液(含5×10个细胞).实验分为3组:扩 增组(18只):输注C组扩增后人脐血细胞;未扩增 组(9只):输注等量新鲜人脐血MNC;空白对照组 (9只):输注生理盐水200tA.移植后观察小鼠存 活情况,6周后处死存活小鼠,收集其外周血和四肢 骨的骨髓细胞,脾细胞及胸腺细胞. 8.流式细胞仪分析存活小鼠的人源性细胞表面 标志:流式细胞仪检测存活小鼠四肢骨骨髓细胞的 CD45,CD34,CD3,CDl9及CD33的含量, 脾,胸腺细胞的CD45,CD34,CD3及CD19的 含量,抗体按产品说明书方法标记上机检测. 9.聚合酶链反应(PCR)法检测人特异的Cart一 工和Alu基因:提取新鲜人脐血细胞基因组DNA 为阳性对照,正常NOD/SCID小鼠外周血基因组 DNA为阴性对照,3-actine作内参照.扩增Cart一工 基因,Alu基因和J3一actine基因的反应体系和条件 相同.扩增产物以20g/I琼脂糖凝胶电泳分析结 果.Alu序列引物正义链为5CTGGGCGA CAGAACGAGATTCTAT一3',反义链为5CT CACTACTTGGTGACAGGTTCA一3',扩增片段长 224bp,为位于人X染色体上重复序列;Cart一工基 因引物的正义链为5'一AAGGATACCA CAATAAGCTGC-3',反义链为5'一GGTTTGTG GAGACTGGCAC一3',扩增片段长156bp,仅位于 Cart一工基因3'末端翻译序列,两者皆与鼠无同源 性;3-actine基因引物的正义链为5'一AAGGC CAACCGCGAGAAGAT一3',反义链为:5TCG GTGAGGATCTTCATGA3',扩增片段长 249bp. 1I).统计学分析:实验数据以均数?标准差表 示,所有数据均采用SPSS软件分析,P<o.05为差 异有统计学意义. 结果 I.不同细胞因子组合对人脐血MNC体外扩增 的作用:扩增组(B,C组)比对照组有明显扩增优势, C组的细胞总数,CD34细胞含量,CFU数, 器官移植杂志2006年4月第27卷第 4I~]ChinJOrganTransplant,Apr2006,Vo1.27,No.4 CD3438一细胞含量和CFU—GEMM数均显着优于 其他组(P<().05),扩增高峰集中于6,10d,第1() d的细胞总数达9×10个,CD34和CD3438一的 细胞含量从od的1.34和0.999/6分别扩增至第 6d的5.45和3,且CFU和CFU—GEMM也有 大幅度增殖,从起始的111个扩增至第10d,分别达 到(1033?246)和(439?75)个集落的高峰. 2.凋亡细胞百分率的比较:在体外未加入细胞 因子的A组,细胞表面AnnexinV的表达前6d迅 速增高,并基本维持高水平;在不含IL-3的B组,前 6d仍可见一个显着的上升(P<().05),随后迅速下 降,到第10d稍低于起始水平;而含有IL-3的C 组,在前6d基本保持起始水平,其后显着减少,到 第14d降至最低值.C组在各时间点的凋亡率均 低于A,B两组,差异有统计学意义(P<O.05). 3.存活状况:移植6周后,空白对照组小鼠均 死亡,未扩增组9只小鼠中存活3只,存活率 33.3,扩增组18只小鼠存活1()只,存活率 55.6,其余均在移植后2,3周内死亡,扩增组小 鼠的6周存活率与未扩增组相比,差异无统计学意 义(P>().05). 4.人造血细胞植入N()D/SC1D小鼠的证据: (1)流式细胞仪检N4,鼠骨髓,脾和胸腺细胞中人类 白细胞抗原CD45:在移植后存活6周的NOD/ SC1D小鼠骨髓,脾和胸腺细胞中均能检出人 CD45细胞,扩增组骨髓中为0.42,2.139/6,未扩 增组为0.1,().969/6,说明存活的小鼠均获得人脐 血造血细胞的植入,扩增组与未扩增组差异无统计 学意义(P>0.05).(2)PCR法检测小鼠外周血细 胞中人Alu基因和Cart—I基因的表达:移植6周后 存活的小鼠外周血细胞与阳性对照相同,扩增出 224bp和156bp的特异性条带,表明小鼠体内存在 人造血细胞.13只存活的NOD/SC1D小鼠均能检 测到人的Alu基因和CartI基因.阴性对照组小 鼠未检测到任何特异性条带.见图1和图2. 5.N()D/SCID小鼠的造血免疫重建:在移植后存 活6周的N()D/SCID小鼠骨髓,脾和胸腺细胞中,我 ? 233? 们均能检出人CD33,CD34,CD3及CD19细胞, 反映人脐血造血细胞已在小鼠体内植入,并开始重建 多系造血,见表1.扩增组1()只存活小鼠中,有8只 在胸腺,脾脏中检测到人T细胞CD3抗原o.15, 1.56,人B细胞CD19抗原o.03,I.599/6,说明扩 增的人脐血造血细胞有助于小鼠免疫功能的重建. M123456M123456 一?注:M:markerDL2()00;1,2:未扩增组Alu基因(图1),CartI 基因(图2)及actine阳性对照;3,4:扩增组移植后存活6 周N()D/scID小鼠外周血细胞Alu基因(图1),Cart—I基因 (图2)及B—actine;5,6:空白对照组外周血细胞Alu基因(图 1),CartI基因(图2)及B—actine阴性对照. 图1移植后存活6周小鼠外周血细胞中人Alu基因 图2移植后存活6周小鼠外周血细胞中人Cart—I基因 讨论 人脐血移植后早期造血恢复依靠祖细胞 (HPC),持久存活则依靠干细胞(HSC),足量的 HPC和少量HSC同时植入,可以加快血象的回升, 减少移植后早期并发症,有助于移植成功].然而 HSC/HPC扩增的过程也是分化的过程,在找到一 套维持HSC质量与数量,同时适度扩增早期祖细 胞的扩增方案是进行临床移植的首要问题. 基于HSC的不对称分裂原则,起始培养细胞 中保留尽可能多的HSC是体外扩增的关键.近年 来广泛采用以CD34细胞或其亚群为起始培养细 胞,但有证据显示人脐血MNC的LinCD34细胞可 能才是更原始的能够重建长期造血和免疫功能的造 血细胞].目前HSC的表面标记尚未完全定论,很 难特异性地分离出HSC和HPC群体,而且在纯化 过程中会使CD34细胞不可避免地丢失],高度 纯化的CD34细胞完全去除其他辅助细胞,不仅导 表1小鼠移植人脐血MNC后骨髓细胞,脾细胞以及胸腺细胞中人源性细胞的含量 (?) 注:未扩增组和扩增组比较,P<o.05 ? 234?中华器官移植杂志2006年4月第27卷第4期 ChinJOrganTransplant,Apr2006,Vo1.27,No.4 致增殖能力的降低,而且移植物抗白血病及移植物 抗宿主效应也会发生改变j.本实验也证明以人脐 血MNC为起始培养细胞不仅HSC/HPC数量得以 有效扩增,而且扩增后的细胞并不妨碍植入与造血 重建.另外短期培养能够尽量保持早期造血细胞的 原始性,人脐血MNC在SCF,FL,IL-6和IL-3的协 同扩增下,6,10d内早期HPC得到最大程度的扩 增,将其植入NOD/SCID小鼠体内不影响植入能 力,并维持了造血重建功能.因此采用MNC直接 进行短期扩增更能满足实际操作和临床应用的需 要,可能是扩增后人脐血应用于临床移植的较理想 方案. 人脐血HSC/HPC扩增最佳的细胞因子组合 至今尚未确定.SCF和FL具有显着的协同扩增作 用,对早期祖细胞的存活,增殖和抗凋亡非常必 要".IL一6是非系特异性造血生长因子,能诱导 HSC进入循环周期『1?,促进造血功能恢复.II,3 与SCF和FI配伍能引导细胞进入增殖周期发挥抗 凋亡作用.本实验结果显示SCF,FL,IL一6和IL一3 的因子组合能够很好地支持人脐血MNC的扩增, 并将扩增后的细胞植入经半致死剂量照射的NOD/ SCID小鼠体内,6周后仍有55.69/6的小鼠存活,而 且我们在存活小鼠的骨髓,脾和胸腺细胞中均能检 测到人CD45细胞,外周血提取的DNA中也能检 测到人特异的Cart—I基因和Alu基因,说明扩增后 的人脐血造血细胞能够顺利植入小鼠体内.另外我 们比较了移植后存活6周的扩增组和未扩增组小鼠 骨髓中人CD34,CD33,CD19和CD3细胞含 量,发现均低于国外文献[1报道,可能由于实验条 件,实验动物差异以及观察时间较短所致;另外扩增 组的CD34和CD33细胞含量显着高于未扩增组, 并且在这些小鼠的脾和胸腺细胞中均能检测出人 CD34,CD3和CD19抗原,说明经过上述因子组合 扩增后的MNC能够在小鼠体内重建多系造血,并 有助于重建免疫功能,这一点与用新鲜人脐血造血 细胞移植无显着性差异.未经扩增的人脐血移植已 被广泛认同为治疗临床血液系统疾病和急性辐射损 伤等疾病的手段之一,扩增后的人脐血造血细胞既 弥补了细胞数量的不足又维持了原有的再植入与造 血重建能力,将有可能成为移植领域的一员. 细胞发生凋亡最早的变化是只存在于质膜内侧 的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外,此时用 AnnexinV与暴露于膜外的PS结合,通过流式细胞 仪PI染色法进行检测是最敏感且简便易行的方法 之一.本实验借此可以观察到细胞因子对细胞 凋亡与增殖的影响恰好是相反的,尤其在有IL一3支 持的培养体系中细胞凋亡显着降低,扩增效率显着 提高,且植入与造血重建能力并无丧失,由此推测抑 制细胞凋亡可能是细胞因子促进细胞增殖的机制之 一 .另外人脐血HSC/HPC在体外扩增过程中细 胞凋亡的减少并非无尺度,而且扩增后的细胞特性 尚未改变. 参考文献 1GluckmanE.Currentstatusofumbilica1cordbloodhematopoiet— icstemcelltransDlantation.ExpHematol,2000,28:1197 1205. 2TanavdeVM,MalehornMT,LumkulR,eta1.Humanstem progenitorcellsfromneonatalcordbloodhavegreaterhemato— poieticexpansioncapacitythanthosefrommobilizedadultblood. 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