食管鳞癌抑癌基因启动子甲基化及微卫星不稳定研究

食管鳞癌抑癌基因启动子甲基化及微卫星不稳定研究 复旦大学博士学位论文 食管鳞癌抑癌基因启动子甲基化 及微卫星不稳定的研究 缪珑舁 博士研究生: / 学 号: 院 系: 肿瘤医院 业: 专 肿瘤学肿瘤外科 导 师: 沈镇宙 教授 导师组成员: 相加庆 副教授 张亚伟 ??~’ 副教授 ?‘ 本课题受上海市科委基金资助, ?..... ..... ?.. 究.. 材料与方法??..? 结果? 讨论小结第二部分食管鳞癌术后复发危险因素的研究 材料与方法结果讨论小结第三部分食管鳞癌微卫星不稳定及与基因改变之间关系的研究?.? 材料与方法结果??.? 讨论??.? 小结参考文献?. 文献综述?..? 附录:攻读博士学位期间发及待发表的论文题录?. 致谢??.. 缩略语索引..?表观遗传学的复杂过程,近年来表观遗传学改变在恶性肿瘤的发生、发展中的作 用越来越受到重视,其中抑癌基因启动子甲基化作为影响基因表达的新机制被广 泛研究,已陆续有文献报道其在预后方面的价值,而食管鳞癌中有关抑癌基因甲 基化与临床病理特征及预后之间关系的研究相对较少。微卫星不稳定则是近年来 恶性肿瘤研究的又一热点,微卫星不稳定是基因组不稳定的表现,导致细胞增殖 及分化异常,促进肿瘤的发生,许多肿瘤中都发现了微卫星不稳定,而食管鳞癌 中有关微卫星不稳定的研究结果差异较大。有关微卫星不稳定与基因甲基 化之间的关系尚无定论,国内也未见相关报道。 因此本研究选取眦、及三个抑癌基因,探讨抑癌基因 甲基化在食管鳞癌发生发展中的作用,并对微卫星不稳定在食管鳞癌中的发生情 况及与基因异常之间的关系做初步的研究。现对上述研究内容分别如 下: 第一部分食管鳞癌、、?基因启动子甲基化的研究 , 目的:.检测食管鳞癌癌组织及配对正常组织中、及? 基因启动子甲基化的发生情况。.评价上述三基因甲基化在食管鳞癌发生发展 中所起到的作用。 方法:收集整理例食管鳞癌患者的临床病理资料,采用酚一氯仿法提取这 例食管鳞癌癌组织及配对癌旁正常组织的基因组,运用甲基化特异 ,的方法对所提分别进行、及?基因甲基化检测,抽选产物进行普通测序或克隆测序, 验证扩增结果。采用步法对癌组织中、及腿缸 基因蛋白表达进行免疫组化检测。分析上述三个抑癌基因甲基化在食管鳞癌及配 对正常组织中的发生情况及与临床病理特征的关系。 ? 结果:.癌组织、及慵基因启动子甲基化的阳性率分别 为.%/、.%/和.%/,正常食管粘膜相 应三个基因甲基化阳性率分别为.%/、./和.%/,复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 中文摘要 ?.、.及腿缸:.基因在癌组织 中的甲基化率均显著高于正常食管粘膜。.食管鳞癌、及 眦蛋白表达阳性率分别为.%/、 .%/、 .%/,?.及舳:.基因启动子甲基化 与相应蛋白失表达显著相关,而基因甲基化与蛋白表达无相关性。. 基因启动子甲基化的食管鳞癌中淋巴结转移更多见., ‰基因启动子甲基化的食管鳞癌中低分化癌更多见.,基因 启动子甲基化与各项临床病理特征无显著关联。 结论:.食管鳞癌中?及?基因启动子甲基化较常见,癌组织的 甲基化率均远高于癌旁正常食管组织,并且导致蛋白失表达,这两个甲基化位点 与食管鳞癌密切相关。.?基因启动子甲基化与肿瘤低分化有关,但与肿 瘤的浸润深度及淋巴结转移等无关,提示这一变化可能出现在食管鳞癌发生的早 期阶段。基因启动子甲基化与淋巴结转移有关,提示其在食管鳞癌的 恶性进展中可能起到一定的作用。.食管鳞癌中有一定频率的基因启动子 甲基化,但与蛋白表达无关,与各项临床病理特征也无关,可能并不直接参与食 管鳞癌的发生发展。 第二部分食管鳞癌术后复发危险因素的研究 目的:.分析食管鳞癌术后两年内复发转移的发生情况及与临床病理因素的 关 系。.评价、及?基因甲基化对于复发的预测价值。 方法:回顾分析了年月至年月在复旦大学附属肿瘤医院接受了食 管癌二野清扫根治手术的患者例,总结术后两年内复发情况,结合第一部分 甲基化的检测结果,应用卡方检验或精确概率法比较复发率的差异,应 用回归分析判定肿瘤复发的危险因素。 结果:.年内例%患者复发。局部一区域性复发占例.%, 其中纵隔淋巴结复发例.%,颈部淋巴结复发例.%。血行转 移占例.%,以肺例、骨骼例和肝例为主,共占血行 转移的.%,局部一区域性复发与血行转移同时发生例.%。.单因素 分析显示淋巴结转移数目.、浸润深度.及淋巴管、血管侵犯 .与复发密切相关,其中淋巴结转移数目?个的患者术后两年复发 ? 率为%。.多因素回归分析显示期.,淋巴结转移数目 .是术后复发的独立危险因子,淋巴管、血管侵犯不是独立危险因素。 .无淋巴结转移食管鳞癌患者中,基因甲基化是唯一与复发相关的 因素,有甲基化患者的复发率显著高于无甲基化患者.%.%,.。 中文摘要 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 结论:.食管癌二野清扫术后两年内%的患者出现复发,纵隔淋巴结、颈部 淋巴结、肺、骨及肝是主要的复发部位,术后应重点对这些部位定期复查。. 及淋巴结转移数目是食管鳞癌术后复发的危险因素,其中淋巴结转移数目? 枚 的患者术后两年复发比例很高,应考虑采取更积极的治疗方法。.? ? 基因启动子甲基化与无淋巴结转移食管鳞癌的术后复发显著相关,可以 考虑将其 作为新的分子标志物用于复发的预测。 第三部分食管鳞癌微卫星不稳定及与基因改变之间关系的研究 目的:.检测食管鳞癌中微卫星不稳定及基因内的位点杂合性 缺失的发生情况。.探讨微卫星不稳定在食管鳞癌中的作用及与基因改 变之间的关系。 方法:以第一部分提取的对癌及癌旁正常组织的基因组为模板,选取 、、及位于基因内的共四个微卫星位点 进行检测,使用荧光标记引物扩增微卫星片段,产物进行毛细管电泳并由序 列检测仪自动收集荧光扫描结果,软件进行数据收集及分析,记录 位点杂合性缺失情况。 并分析上述四个位点的微卫星不稳定发生情况及 、及 结果:.食管鳞癌发生率是%/,其中 位点分别有例、例和例。位点未发现微卫星不稳定,也未发现两个 位点同时有?的病例,例均为?。.?与各项临床病理 因素均无显著关联。.基因内位点的杂合性缺失率为.%,但 与儿蛋白失表达及基因甲基化均无显著关系。.?与基 因甲基化、杂合性缺失及蛋白失表达均无显著关系。 结论:.食管鳞癌中仅存在一定比例的低度微卫星不稳定?,未发现高度 微卫星不稳定。.与各项临床病理因素均无关,在食管鳞癌的发 生发展中可能不起关键作用。.基因异常可能不是?发生的原因。 .基因内 位点有较高的杂合性缺失率,基因可能是食管鳞 癌基因改变的靶点,但基因缺失与甲基化及蛋白表达均无关,是否存在突变 等其 他异常有待进一步研究。 关键词:食管鳞癌;甲基化;微卫星不稳定;杂合性缺失;;; ?;甲基化特异多聚酶链扩增反应;免疫组织化学 中图分类号: .. , ., . . .. . , ,. 、 ? . . ,, .脯 :.、 ?.. . :.: . .%/,.%/和.% ,, ? .%/、.% / , . /和.%/ .. .%/, ,, ? .%/,.%/. ?:. ?..删 .. ? .,眦?? .,. :. 根《, . ..? ?... ,. , 英文摘要 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 . . :. 、曦 .: ?, . . ., 、 ,’ ?. . ? . :.% ,.% ..% , .% , , .% , ,,.% ,.%... .、 . . . ? . %..一 . , ..? ? ?, ..? . ?. ?:. ? .. .: . , 一,,, . . ? . . :. %/. , 一 . ,, ,. 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 英文摘要 .. ?, ...% , , ,? .. , , . :.? ?. ... 。 ..? .. , .删, . : ; ;: :;;胍: :? : ? 引言 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 引 言 食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,全世界每年新发病例近万,发 病率及死亡率均超过/万。我国是食管癌高发及死亡率最高的国家,% 的食管癌发生于我国,以鳞癌居多,占%以上。在过去的年中,食管癌的 诊断和治疗有了较大的进展,但预后仍较差,全世界每年有万人死于此类疾 病。因此食管癌的预防,早期诊断,治疗新方法的探索十分重要,而这都依赖于 对其癌变机制的深入研究。 恶性肿瘤的发生是一个多阶段,涉及遗传学及表观遗传学的复杂过程。近年 来表观遗传学改变在恶性肿瘤的发生、发展中的作用越来越受到重视。表遗传学 的研究对象不是基因组核苷酸序列所携带的遗传信息,而是研究基因表达在时间 和空间上的调控问题,其中最主要的两个研究内容是甲基化和组蛋白修饰, 二者参与了基因的转录调节,已成为目前分子生物学领域研究基因表达调控的热 点。 肿瘤中的甲基化改变包括全基因组的低甲基化和局部区域的过度甲基化。一 般认为,全基因组的低甲基化可以激活原癌基因,还可以通过染色质结构的改变 影响基因组的稳定性,而过度甲基化主要发生在抑癌基因,抑制后者的表达。除 此之外,组蛋白修饰,主要是抑癌基因的低乙酰化,常与甲基化相互影响, ? 共同调控基因的表达,从而影响肿瘤的发生和发展。 甲基化,即在中胞嘧啶残基第五碳原子上共价结合加上一个甲基, 它是人类中唯一的一个共价修饰。甲基化是一种基因外修饰,而不是基因 的改变,因为它尽管影响了的结构,但并没有实质性的改变基因编码。 甲基化是在转录水平调控基因的表达,通过基因启动子及其附近区域内岛 的甲基化关闭基因。 人类肿瘤中启动子甲基化水平升高是年由首先报道的, 在肺癌和淋巴瘤中降钙素基因的启动子区存在高甲基化。但直到年 甲基化特异性技术出现以后,对恶性肿瘤抑癌基因启动子甲基化方面的研究 才大量开展起来嘲。现己发现恶性肿瘤中存在大量抑癌基因超甲基化情况。实际 上,之所以甲基化在癌发生过程中如此引人注目,是因为癌组织中存在一些基因 编码“正常,而蛋白不表达的基因,也就是说这些基因不表达的唯一原因就是 其启动子区的甲基化。随着研究进展,肿瘤中因为甲基化而失去表达的基因不断 被发现,这些异常的甲基化模式能够代表某一肿瘤的特点,从而可被用于肿瘤的 分类和分期,特别是某些甲基化率较高的基因,有可能被用于疾病诊断、危险评 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 引言 估、预后预测等方面。当然,也并不是所有存在甲基化的基因在肿瘤发展中均起 作用,尚需对这些存在异常甲基化的基因进行深入研究才能确定其在肿瘤发生过 程中的作用。 ?、及三个抑癌基因在多种恶性肿瘤中已被证实存在 一 较高频率的甲基化,食管癌中有关甲基化研究在深度及广度上落后于肺癌, 肠癌,胃癌等恶性肿瘤,而且对食管腺癌的研究相对较多嘲。国内的食管癌表遗 传学研究起步不久,细胞株及小样本的研究较多,对于甲基化与临床病理特征及 与预后之间关系的研究较少,而深入了解这一表遗传学改变的临床病理特征及预 后价值对于其在临床实践中的应用是一项基础而重要的衔接工作。 食管癌是一种致死性很高的疾病,手术仍是其主要的治疗手段,食管外科经 历了近一百年的发展,手术安全性及技巧都显著提高,但五年生存率仍较低,超 过一半的患者术后出现复发,且多在术后两年内。包括放化疗在内的个体化综合 治疗是现代食管癌治疗的新模式,而对食管癌术后复发情况及预后因素的研究, 将为手术方式及综合治疗的选择提供依据。已陆续有文献报道了抑癌基因甲基化 在预后方面的价值,而食管癌方面相关的研究还很少。 本研究以食管鳞癌这一国内常见的食管癌病理类型作为研究对象,选取 ?、及三个抑癌基因进行甲基化检测,同时对食管鳞癌的 临床病理特征及术后复发情况进行总结,探讨上述抑癌基因甲基化在食管鳞癌发 生发展中的作用及其预后价值。 尹基化的研究方法包括两大类:一类是全基因组序列特异性甲基化分 ? 析,检测方法主要有限制性内切酶酶解法、甲基化酶温育法、高效液相色谱 法等方法,这些方法只能检测基因组的甲基化,并不能具体到特定的基因和 位点。另一类是特定片段的甲基化检测,包括印迹、限制性内切酶、 测序法、甲基化特异性、甲基化敏感性单链核苷酸引物延伸、变性高 效液相色谱法、微阵列技术 等方法。的敏感性特 异性均较好,操作相对简便,是目前国际上应用最为广泛的甲基化检测方法。它 根据未甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢盐处理后脱氨基而转变成尿嘧啶扩增后 转化成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶受甲基基团的保护不会转变为尿嘧啶 扩增后仍为胞嘧啶的原理,针对目的岛分别设计未甲基化和甲基化特异性 的引物,以敏感高效的方法进行扩增,以产物来判断甲基化情况。本研究 中就是通过甲基化特异性的方法进行甲基化检测。 一 所有遗传学或是表遗传学的变异最终都要通过其蛋白表达的改变在肿瘤中 发挥作用。蛋白水平的改变应用免疫组织化学法和印迹分析法即可相当 敏感地检测出来,因此其出现比基因水平的研究要早,研究的范围也更大,对于 引言 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 大多数基因往往是先发现其蛋白表达水平的改变,然后再发现了其基因的改变。 只要对其基因的变化有了深入的了解,对其蛋白产物的改变就比较容易理解了。 比如基因扩增只会引起癌基因的过度表达,抑癌基因的甲基化和基因缺失则只可 能引起其蛋白表达产物的减少,而基因突变则既可能引起基因激活,也可能引起 基因失活,也可能没有什么作用,即所谓的无义突变。但有时遗传或表遗传的改 变与其蛋白产物表达不能联系上,如在基因中,它的作用机制非常复杂, 具体何种变异方式的作用较大,尚存在一些争议。因此本研究亦准备对上述三 个抑癌基因的蛋白产物行免疫组化检测,探讨基因的甲基化是否为相应蛋白产物 下调的主要原因。 肿瘤的发生是多因素、多阶段与多基因相互作用的结果。表遗传学修饰和遗 传学改变如微卫星不稳、基因突变的关系是研究的热点。近年来,已有一些研究 表明散发性肿瘤的错配修复基因启动子高甲基化与微卫星不稳定有关。 微卫星,又称短的串联重复序列 或简单序列重复 ,,由个核苷酸组成,具有 高度多态性,广泛存在于原核及真核生物基因组中,尤以二核苷酸重复序列即 /最为常见,为重复次数,通常为?次,而且重复单位结构相同, 通常认为微卫星是重复期染色体不对称交换所致。微卫星的功能目前尚不完全清 楚,从基因的结构分析,重复序列位于启动子、基因编码区、内含子区域或内含 子与外显子的交界区。因此,认为其是基因重组的热点,参与基因的重排与变 异, 对基因的表达调控,维持基因组稳定等方面有重要作用,是一类新的多态、信息 ? 容量高的分子标志。 微卫星不稳定是指基因组中微卫星重复序列的重复次数的增加或丢 失,导致微卫星长度的改变。通过的复制和细胞分裂而被保存在基 因组中,增加了其它基因的不稳定性,进而出现整个基因组的不稳定,导致细胞 增殖及分化异常,从而促进肿瘤的发生,的发生原因一般认为是由于错配修 复基因功能缺陷,不能正常地发挥错配修复作用所致。目前已发现错配修复系统 包括个删基因:、、、、和。删系 统中任何一个基因发生改变,都会使细胞错配修复功能缺陷。最早发现的 遗传性非息肉病性大肠癌?中,分别表现,,和 的基因突变。而有研究表明对于的散发性恶性肿瘤,基因启动子甲基 化可能是导致的主要原因喳。 食管癌中微卫星不稳定的研究结果差异较大,微卫星不稳定在食管癌中是否 高发,微卫星不稳定对于食管癌的发生发展是否有重要作用都有争论,而食管癌 中有关基因的研究很少,国内未见有关基因甲基化与微卫星不稳定复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 引言 之间关系的研究,因此本研究对食管鳞癌中、等位基因缺失及 基因甲基化进行了检测,探讨在食管鳞癌中的作用以及基因异常与 之间的关系。 ? ? 恶性肿瘤的发生是一个多阶段,涉及遗传学及表观遗传学的复杂过程。表观 ? 遗传学是指在不改变基因编码序列的前提下,通过和组蛋 白的修饰来调控基因表达,其中甲基化最为常见。近年来甲基化在恶性 肿瘤的发生、发展中的作用越来越受到重视,岛的过度甲基化被认为是抑癌 基因失活的一个新的机制。本研究即准备应用甲基化特异性 ? ,及免疫组化方法,对例食管鳞 癌及癌旁正常组织的、和?基因启动子甲基化及癌组织 相应的蛋白表达进行检测,探讨这三个抑癌基因甲基化在食管鳞癌发生发展 中的 作用。 、及胍缸基因的简要信息见表七 ? 坦 ?口 血 督 趔 删 螳 衄 嫌 ‘ 兰 号 寸 互 叁 墨 暑 盎 营 ‘荟 . 。晶 要 高 ? 一 二 .曼 写 ’ 三 。 堂 一 港 呙 黑? 、 剞 困 基二 由翼 写 。 呈 醐 一 暑 西 ’ ?暑 量 三 。 蚤 。 互 量 ,’一 留 害 咂迎瞰坦困郴;.。越 喜 黾 虿 星 菪 宅 名 昌 .量 占 ? 港 渲 ‘ 五 兽 号 困 晕 ‘ , 勺四?. 时 ? 捌 杈嵇爿蚪删妖器掣扑千蛙蝼替扑叫蛾 蛊第一部分 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 材料与方法 、研究对象 收取年月至年月间在复旦大学附属肿瘤医院胸外科手术切除 的食管鳞癌标本例,同时收取同一患者癌旁正常食管粘膜组织位于切缘。 所有病例均为初治患者,年龄岁,中位年龄岁,其中男性例,女 性例,根据临床分期:期;期;?期。术前均未行放 化疗,无任何肿瘤家族史,所有肿瘤标本于术后半小时内新鲜取材,并置于? 液氮中保存。免疫组化检测的切片取自同一批患者的肿瘤组织存档蜡块。 、组织基因组的抽提 主要试剂 ? , 组织裂解液: , ,加蒸馏水至 缓冲液: ?., . 蛋白酶:公司,配制成/备用 主要仪器 纯水设备 ?冰冻切片机 电热恒温水槽一型,上海医用恒温设备厂 离心机,公司 紫外分光光度计 ,美国 数显计一型,上海天达仪器有限公司 实验步骤酚一氯仿法 新鲜标本 连续冰冻切片,取张左右置入.的管 中;先加入 裂解液,再加入蛋白酶调整至约 /,。过夜; 组织裂解完全后?加热分钟,灭活蛋白酶; 加入等体积酚/氯仿/异戊醇::,混匀后,室温离心 分钟; 吸取上清,加入等体积氯仿/异戊醇:,混匀后,室温离 心分钟; 吸取上清,加入等体积异戊醇,一?放置小时;,离心 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 第一部分 分钟; 弃上清,加入%的冷乙醇清洗,,离心分钟,重复 次; 弃上清,室温干燥后加溶解,紫外分光光度计测定浓度后保存。 一 、检测 主要试剂 :购自上海吉泰生物有限公司。 :购自上海公司。 :购自上海天根生物科技有限公司。 琼脂糖:购自上海奇康生物有限公司。 甲基化试剂盒 :购自上海生物技术有限公司。 . 电泳缓冲液: 碱,硼酸, .,加 水至。 主要仪器 电热恒温水槽型,上海医用恒温设备厂 离心机,公司 紫外分光光度计 ,美国 仪型 , 水平电泳仪器::?电泳系统: 凝胶成像摄录系统型, , ? 甲基化特异 , 的甲基化修饰处理的制备:在使用前现时准备,取一支 ? 无菌水, 及 固体混合物:力 的?的 ,在室温下避光溶解并震荡。,各取 样品入 ?按测定的浓度调整各样品的浓度为/ 薄壁管中,然后在每管中加入新鲜配制的 ,震荡混匀样品。 ?将各样品管放到仪中按如下步骤操作:培养,培养., 立刻进行下述操作或在下存储最多。?添力 的? 到? 中,并将柱放入 ? 试剂盒所提供的 中。 ?装填样品到含有 的 中,盖上盖将 柱颠倒数次来混合样品。 管中,然后离心 来洗脱为了增加洗脱 的量可重复洗脱次,可立刻进行分析或存储在?备用。 的甲基化阳性对照处理 ?取正常人外周血,先用淋巴细胞分离液提取淋巴细胞,再抽提。?.酶处理: 淋巴细胞 × .. .酶 . 双蒸水 总体积 上述反应体系混匀后,于孵育小时。 ?孵育后的再进行甲基化修饰后一?保存。 反应 ? ?、?和的反应的引物序列、扩增片段大小、退 火温度及参考文献见表。 ?反应体系总反应体系. ×. ./ . / .上游引物 / .下游引物 / .多聚酶 ’ 模板~ ?反应条件为:预变性;。,特异性退火温度, 共扩增个循环;延伸后结束。 第一部分 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 ?凝胶电泳:取 产物以%琼脂糖凝胶、.电泳。正常人外 周血淋巴细胞进行甲基化修饰后作为未甲基化对照,正常人外周血淋 巴细胞先经.酶特殊处理后再经甲基化修饰后作为甲基化对照。 ?反应结果的判断标准:电泳后凝胶置于紫外凝胶扫描摄录系统中观察 结果,产物电泳时只出现未甲基化条带时,该样本计为未甲基化, 产物电泳时出现甲基化条带,无论是否出现未甲基化条带,均计为甲基化。 抽选样本送上海英骏生物技术有限公司进行测序直接测序或克隆后测 ? 序,验证结果的准确性。 、检测 主要试剂及设备 缓冲液: , ,浓盐酸,加蒸馏水至充 分混匀即可。 柠檬酸缓冲液:柠檬酸, 调至.,加蒸馏水至。 .的抗原修复液:购自上海硕盟生物科技服务有限公司。 显色试剂:由复旦大学附属肿瘤医院分子病理中心免疫组化室自行配制。 免疫组织化学用湿盒:购自上海位点生物科技有限公司。 ?恒温温箱: 型。 电饭煲:爱德牌,上海五星电器有限公司。 显微镜及显微摄像系统:,。 试剂购自公司 ? 各基因的检测的阳性定位和抗体一抗的信息:见表。 表 抗体简要信息 实验步骤 采用免疫组化二步法,实验步骤如下: 取存档腊块制成的连续切片,恒温烤箱中烤片?小时,二甲苯脱 蜡,梯度酒精至水。 将切片移入电饭煲水浴中?和腿拈用./.的柠檬 第一部分 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 酸/柠檬酸钠抗原修复液、用./.的抗原修复液,温 度保持在一,煮分钟,保温分钟,进行抗原修复,取出后在室 温下自然冷却。缓冲液洗次。 滴加一抗? /片,根据抗体不同选用不同的稀释度:一 :,以稀释,在湿盒中孵育分钟后移入室温过夜。 洗涤,每次分钟×次。、 滴加即用型二抗, /片,室温下孵育分钟。 洗涤,每次分钟×次。 显色一分钟或显微镜下观察显色至合适程度,自来水终止显色。 流水洗,苏木素衬染?分钟,盐酸酒精分化数秒,自来水冲洗蓝化。 递增梯度酒精脱水,二甲苯透明,常规树脂封片。 结果的判断: 切片内癌旁正常食管上皮做阳性内对照,用代替一抗作空白对照。结合 染色强度和染色范围判断结果。显色阳性反应为在特定的区域出现定位 明确、对比鲜明的棕黄色或棕褐色。和蛋白阳性反应定位于细胞核, 蛋白阳性反应定位于细胞膜。参考文献,各个指标的结果判断标 准为:?嘲以阳性反应的肿瘤细胞数目占所有肿瘤细胞%视为结 果阳性,%为阴性。嘲和口以阳性反应的肿瘤细胞数目 占所有肿瘤细胞%视为结果阳性,为阴性。 、统计学分析 采用 .软件进行分析。率的比较采用卡方检验或精确概率 法。均为双侧检验,检验标准为.。 一巴 一 一。一 藿仪种抵 ?? ? 卜? ?一 越赠?粤 卜? ?? ?一 ?? ?? 的.【一 一舍一 ?蕊止 求锭躲 、?。、?熄卜 《一《《一、《 《譬?譬 《?司?《 《?《?《 《《《卜一《《《卜《《一 《《《一一《一《?《《 . .?撵叫 昌《昌《《昌《昌 卜。《昌《昌工。普《 .、.《一《《卜一《 臼《???《《一、.《卜 一。一.《《《一一。《一?? ?《一苫一一《《一《.一 譬函醐 港 .【,墨 翌 州 口哂?? 轾仪粑孤哒越赠?赠罢?鄙女磐轼,赢世而通哒僻 议蹬爿蚌州袄奄掣扑千琏蝼铎扑叫聪第一部分 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 结 果 、检测结果 ? 癌组织及正常组织中、和?基因启动子甲基化的阳 性率 共例食管鳞癌及癌旁正常食管粘膜进行了的检测。其中,癌组织中 基因启动子甲基化的阳性率为.%/,基因启动子 甲基化的阳性率为.%/,?基因启动子甲基化的阳性率为.% /。正常食管粘膜中、、?基因启动子甲基化的阳 性率分别为.%/、.%/、.%/。各基因产物电 泳结果的示例图见图至图。阳性样本的产物测序结果的示例图见图 至。 .图 基凶产物电泳示例图 循 复口.大学攻读博士学位研究生毕业论文 第一部分 . ? 幽卜 ?基凶产物电泳示例图 注:产物电泳示例图中:甲基化条带,:未甲基化条带;:食管鳞癌, :癌旁正常食管粘膜,:未甲基化阳性对照,.:甲基化阳性对照。 ,? ? 重 . ‘曩 , 舀零叠 仁譬 琴童 雏 ’弓?? 弓 . 图一 ?基因产物测序结果示例图 注:测序图.为甲基化特异目的条带测序图谱,箭头所示碱基经过 亚硫酸氢盐处理后原有胞嘧啶仍旧保持完整。?为非甲基化特异目的条 ? 带测序图谱,经过亚硫酸氢盐处理后原有胞嘧啶全部转化为了尿嘧啶 箭头所示;为该基因启动子区部分野生型序列。分 图 基因产物测序结果示例’? 譬,?? 翟?,冒譬 ?? . 了泰 譬下了套下『 譬叠 ?? 重曩譬 ‘? . 图 基因产物测序结果示例复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 第一部分 正常食管粘膜与癌组织?、和‘?基因启动子甲基化的阳 性率比较 正常食管粘膜各基因的启动子甲基化阳性率均显著低于癌组织, 基因启动子甲基化在正常食管粘膜与癌组织中的阳性率,分别为 .%、.%:.,基因启动子甲基化在正常食管粘膜与癌组织中的阳性率,分别 为.%、.%.、?基因启动子甲基化在正常 食管粘膜与癌组织中的阳性率,分别为为.%、.%.,结果见表 至表。 表食管癌及正常食管粘膜基因启动子甲基化检测比较 表食管癌及正常食管粘膜基因启动子甲基化检测比较 ? 表食管癌及正常食管粘膜?基因启动子甲基化检测比较 、癌组织检测结果第一部分 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 、和?基因检测结果 蛋白表达阳性率为.“/,蛋白表达阳性率为 .%/,?蛋白表达阳性率为.%/。各基因检测结 果的示例图见图?至?。 、和‰基因启动子甲基化和相应蛋白表达的关系 .、?.基因的启动子甲基化和相应 蛋白失表达密切相关,而儿基因的启动子甲基化和蛋白表达没有显 著性关系。结果见表至表?。 表 基因启动子甲基化与蛋白表达的关系 表 基因启动子甲基化与蛋白表达的关系 ? 表 ?基因启动子甲基化与蛋白表达的关系复旦人学攻读博士学位研究生毕业 论文 第一部分 、食管鳞癌抑癌基因启动子甲基化和临床病理特征的关系 基因启动子甲基化的病例中淋巴结转移更多见.,有 分化更差及浸润深度更深的趋势,但未达到统计学意义,值分别为., .。其他临床病理特征未发现具有统计学显著性差异。 州基因启动子甲基化的病例在低分化癌中更多见:.,有淋巴结 转移更多见的趋势,但值未达到统计学意义.。其他临床病理特征未 发现具有统计学显著性差异。 基因启动子甲基化与各项临床病理特征均无统计学显著性关系。结果 见.表 ?,右边为坏死组织 图?鳞癌组织?阴性表达,定位于胞核,~~ ~ 一 ? ?水. 毋一.卜? 誉?? %甘 水 永?.?? 毋卜.? 永。卜 长一?寸 毋. ? 一.【 ?? 卜 ?甘 孚?卜?寸 长 霉 一 呻 ? ??一 ? ???. ???. ?. . . 的. 乎.【..【? 一冰?. .? 毋卜. . 卜. 式寸 葶?? 水 .?? 长卜.寸 毋.盼 撰西.?呻 ? 水.寸?呻 ? 西? 寸 甘 ? ?一 ? 术一 毋西.呻 永.? .?一 毋寸.? 承?. 霉. 毋鼍? %. 长?.寸 .【.? 水?.呻 永曲寸吩 ? ? 呻 ??.【 【 ?一 ?一 呻一 一 ?. 甘?. ?呻. ??. . 呻卜. 卷. 霉.? 誊.?寸 永?奇? %? 母? . 术卜. ?.? 毋. 水甘.甘 %.? 卜?? ? ? 。卜 卜甘 ?卜 ? 卜? ?? 。吩 一 一甘 呻 长 毋.? 呻 毋 母. 更. 长 .? 长卜.卜 “? 水?‘ 长旧.呻 蒿.西 ? 田 ??寸呻 呻 ?? ?? 一? 一一 ?一 卜一 卜?. . 呻. 卜. 甘. 寸. 毋?.? . 水?. 田 ?.? 更.寸西 ? 冰?.? 曲. .【呻 长西.? 孚?.田。 承寻寸? 卜 ? ? 甘 ?.【 ?寸 ?寸 ?? ? 卜 ? 簿毒毒 , 螵口 掣区 掣医 趔山 目 靼山 蓑 黑求要一介导间接增强了转录抑制蛋白的作用,导致相应基因的表达水平降 低或缺 失,进而下调蛋白的表达,最终出现细胞生长分化失控,发生食管鳞癌细胞的 恶 性转化。 、州基因启动子甲基化与食管鳞癌的关系 ?基因是细胞周期调节基因之一,其编码的蛋白是细胞周期蛋白激酶 的抑制因子,主要起到抑制细胞增殖的作用,?基因失活使癌细胞 顺利的通过关卡,得以无限增殖。眦是目前甲基化研究比较集中的抑癌 基因。在大肠癌、肺癌、前列腺癌及口腔癌等多种肿瘤中‰基因启动子都有 较高的甲基化率【‘】。 食管癌嘲基因启动子甲基化的发生率报道不一,在%%‰烀培’妇之间, 这可能与所选取的甲基化位点不同,病理类型不同及地域差异有关。本研究 在 例患者中发现腿铀基因启动子甲基化例,发生率为.%,与?报道的 ? 相近,并且显著高于癌旁正常组织的发生率.%。 大多数食管癌中都存在腿缸蛋白失表达,但嘲基因突变率较低阳幻,多 数文献认为甲基化是?蛋白失表达的主要原因?堋,少数文献报道?基 因甲基化与蛋白表达无关九,本研究中嘲蛋白表达阴性的有.%,甲基化 阳性病例中蛋白表达阴性的占.%,嗍基因启动子甲基化与蛋白失表达 显著相关.。 关于?基因启动子甲基化在食管癌发生发展中的作用,意见不统一,有 研究认为其多发生在食管癌的中晚期?,也有研究发现从癌前病变到癌变的 各 个阶段都可以观察至吣基因启动子甲基化?一,并且与淋巴结转移及分期无 关,因此认为?基因甲基化在食管早期癌变过程中的作用更大。本研究中 眦基因启动子甲基化在低分化癌中更多见:.,与浸润深度、分期等 临床病理特征无关。 从本研究看食管鳞癌中臁铀基因启动子甲基化较常见,是蛋白失表达的原 因,与食管鳞癌密切相关。临床病理特征方面仅与分化程度相关,甲基化频率在 不同分期的食管鳞癌中保持相对稳定,与肿瘤的浸润深度及淋巴结转移等无关,复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 第一部分 提示这一变化可能出现在食管鳞癌发生的早期阶段,是食管鳞癌发生的早期事 件。 、基因启动子甲基化与食管鳞癌的关系 基因位于,编码的是一种钙依赖性细胞粘附分子,起着介 导同种细胞粘附和维持正常细胞形态完整性的作用。蛋白失表达使癌 ? 细胞与邻近细胞间的粘附作用降低九,从而增强癌细胞的转移和浸润能力,在肿 瘤的浸润转移中起到至关重要的作用。食管癌方面,日本一项大规模多中心研究 对名食管鳞癌的预后进行了分析,多因素分析显示除了分期及分期之外, 蛋白失表达也是食管鳞癌预后的独立影响因子九。 在肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、头颈部肿瘤及胃癌等多种恶性肿瘤中都已证实了 甲基化是?基因失活的主要原因钉。食管癌中有关基因启 动子甲基化的研究多集中在腺癌中‘删?,嘞等报道食管腺癌中?基 因启动子甲基化高达.%,食管鳞癌中口等报道在例食管癌中发现 例%基因启动子甲基化,并与蛋白表达下调有关。本研究在 例食管鳞癌中发现了例.%?基因启动子甲基化,癌组织中的 发生率显著高于癌旁正常组织,.%的癌组织存在蛋白失表达,与 甲基化显著相关.,研究结果与口等相近。 关于食管鳞癌中?基因启动子甲基化的临床病理特征,文献中尚未 见对其进行独立、系统的总结,本研究发现伴有基因启动子甲基化的 病例中淋巴结转移更多见.,有分化更差及浸润深度更深的趋势,但未 ? 达到统计学意义,值分别为.,.。 从本研究看基因启动子甲基化在食管鳞癌中十分常见,与蛋白失 表达密切相关,临床病理特征方面有淋巴结转移多见的显著特征,并且有分 化更 差及浸润深度更深的趋势,作为公认的肿瘤转移抑制基因,基因启动 子甲基化所导致的基因失活在食管鳞癌的恶性进展中可能起到重要作用。 、基因启动子甲基化与食管鳞癌 是错配修复基因的一员,自年首次分离到与大肠杆菌同源 的人基因以来,已发现和人类的错配修复反应有关的有、、 、、及共个基因。错配修复基因保证了复制的高 度保真,对于维持基因内部的稳定性和完整性起着重要的作用。错配修复基因失 活将导致机体错配修复功能的降低,进而导致整个基因组的不稳定,使某些癌基 因和抑癌基因的突变在体内得到快速聚集,肿瘤由此发生。 在头颈部肿瘤,胃癌及子宫内膜癌等恶性肿瘤中都报道了基因启动子 甲基化是其基因失活的主要机制晒蜥。但在食管癌中相关研究相对较少,而且结第一部分 复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 论差异较大,阳等报导在例食管鳞癌中没有发现一例基因启动 子甲基化,而蛋白表达下调的有%。嘲等报导基因启动子 甲基化发生率在食管癌组织和癌前病变组织中分别是.%和.%,并且甲基 化发生率随着病变程度的加重而增加。有关基因启动子甲基化与蛋白表达 的关系,结论也不一致,旧等在食管腺癌中未发现两者相关,而嘲 等在食管鳞癌中发现基因启动子甲基化是蛋白失表达的主要机制。 本研究中例食管鳞癌中发现了例基因启动子甲基化,发生率 为.,但与蛋白表达无关:.。分析可能的原因有以下二点:首先 基因启动子甲基化和相应基因表达的调控不是简单的线性关系,真核细胞的基因 表达调控非常复杂,涉及多种过程和机制,基因启动子甲基化只是其中的一个重 要方面,对于某些基因可能其重要性要大一点,甚至起主导作用,而对于另外一 些基因则可能影响小一点。遗传学机制如基因突变、缺失也参与基因表达的调控, 从本研究目前的研究结果看甲基化可能不是蛋白失表达的原因,基 因是否存在突变等其它遗传学改变则有待进一步的研究。其次本研究检测采 用的是新鲜组织标本,而检测采用的则是福尔马林固定过的组织的石蜡切 片,肿瘤存在异质性,不同区域的取材可能会影响结果。 有关基因启动子甲基化与食管鳞癌临床病理特征之间的关系,本研究 未发现二者存在显著的关联, 因此虽然在食管鳞癌中发现了一定比例的 基因启动子甲基化,但尚无证据证明其在食管鳞癌中起到重要作用,是否通过其 他途径间接的对食管鳞癌的发生发展产生影响有待进一步研究。 ? 、癌旁正常组织的抑癌基因甲基化 文献中报道在食管癌癌旁正常组织中也可检测到抑癌基因甲基化情况哺,本 研究也有类似的发现,例癌旁组织中分别检测到?基因甲基化例, ?基因甲基化例,基因甲基化例,其甲基化率均显著低于 癌组织,这一方面说明了这三个甲基化位点是肿瘤特异性甲基化位点,另一方面 也表明某些抑癌基因甲基化可能参与正常食管的癌变过程。有研究表明瞳蚓食管 从轻度到中度到重度不典型增生直至最后癌变过程中,抑癌基因甲基化的发生率 不断提高,牵涉的抑癌基因也越来越多。呻等对伴有和不伴有食管腺癌或不 典型增生的两组正常食管粘膜进行了种基因的甲基化检测,前者的甲基化发 生率明显高于后者,而两者在组织学上难以区别。与遗传学中经典的突变聚集致 癌学说相似,一系列的表遗传学改变的积累,最终导致正常细胞转化为肿瘤细胞。 在许多情况下,某些基因的甲基化可能早于明显的恶性表型出现,因此甲基化检 测可能对提高肿瘤的早期诊断有所帮助。 恶性肿瘤的发生是一个多阶段,涉及遗传学及表观遗传学的复杂过程。表遗复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文 第一部分 传学的研究对象不是基因组核苷酸序列所携带的遗传信息,而是研究基因表达在 时间和空间上的调控问题,其中的甲基化研究为肿瘤的早期诊断、预后判断和干 预治疗提供了新的思路,并且已经展现了良好的前景。兼具肿瘤特异性和组织特 异性的甲基化位点有望成为一种崭新的分子生物学标记,应用于肿瘤的预防和诊 治。 综上所述,本研究表明?、基因启动子甲基化在食管鳞癌中 是一种比较常见的现象,是蛋白失表达的原因,参与食管鳞癌的发生、发展。 其 中觚缸基因启动子甲基化只与肿瘤分化有关,可能是食管鳞癌发生的早期事 件,而?基因启动子甲基化与淋巴结转移有关,可能参与了食管鳞癌的 恶性进展。食管鳞癌也存在基因启动子甲基化,但本研究未发现其与蛋白 表达及临床病理特征之间的相关性。 小 结 .食管鳞癌中删及?基因启动子甲基化较常见,癌组织的甲基化 率均远高于癌旁正常食管组织,并且导致相应蛋白失表达,这两个甲基化位 点与 食管鳞癌密切相关。 .?基因启动子甲基化与肿瘤分化有关,但与肿瘤的浸润深度及淋巴结转 移等无关,提示这一变化可能出现在食管鳞癌发生的早期阶段。基因 启动子甲基化与淋巴结转移有关,提示其在食管鳞癌的恶性进展中可能起到 一定 的作用。 .食管鳞癌中有一定频率的基因启动子甲基化,但与蛋白表达无关,与各 项临床病理特征也无明显关系,可能并不直接参与食管鳞癌的发生发展。 ?第二部分 ,食管外科已 一半 仍较差, 抑癌基因启动子甲基化是抑癌基因失活的一种主要方式,食管癌中有超过 种抑癌基因存在启动子甲基化嘲,并且已陆续有研究认为抑癌基因甲基化是 一种预后因子删。本研究回顾分析了例食管鳞癌的临床资料,对术后两年 内的复发情况进行了总结,结合第一部分、、?三个抑癌 基因甲基化的检测情况,对食管鳞癌术后复发的危险因素进行了探讨。 材料与方法 、入选病例 年月至年月间名病理确诊的食管鳞癌患者,在复旦大学附属 肿瘤医院接受了食管癌根治手术。其中例行二野淋巴结清扫的患者入选本次 , 术式,例行翻身三切口术式。 研究研究对象同第一部分,例行 男性名,女性名,中位年龄?.岁岁,平均每例清扫淋巴结 ?.?枚。入选条件包括术后病理分期一?期;肉眼无肿瘤 残留;未接受过术前放、化疗;手术后病理检查食管上、下切缘无癌细 胞残留。肿瘤的解剖定位及分期依照标准。 、手术方式 手术径路:有两种:一种是 径路:先平卧,腹部正中切口,完 成腹腔清扫并游离胃,扩张膈肌食管裂孔,关腹。改左侧卧位,右胸第五肋间 进 胸,完成胸腔清扫并游离食管,胸顶行胃食管吻合。另一种为径路翻 身三切口:先左侧卧位右胸第五肋间进胸,完成胸腔清扫及食管游离,改平卧 位,腹部正中切口完成腹腔清扫及胃的游离,同时行左颈斜切口,游离出颈段食 管后,将胃提至左颈行胃食管吻合。 清扫范围:均为胸腹二野淋巴结清扫。胸部清扫:上中下段食管旁、左右肺 门、隆突下、上纵隔喉返神经旁淋巴结及膈上淋巴结。上腹清扫:贲门旁、胃小