【word】 一种便捷而经济的显微注射针填充方法

【word】 一种便捷而经济的显微注射针填充 一种便捷而经济的显微注射针填充方法 2007年8月 第l7卷第8期 中国比较医学杂志 CHINESEJOURNALOFCOMPARATIVEMEDICINE Au~st,2007 ,,,,,e屿) 技术方法 分, 一 种便捷而经济的显微注射针填充方法 范昌发,左琴,李保文,李波,岳秉飞 (1.中国药品生物制品检定所实验动物中心,北京l0005o;2.中国药品生物制品检定所国家药物安全评价监测中心,北京100050) 【摘要l介绍了一种便捷而经济的将DNA溶液填充至显微注射针的方法.将通常用于转移胚胎的口吸管 稍加改进,吸取DNA溶液,从尾部直接注入显微注射针,可在2,5min完成DNA填充,大大提高了效率. 【关键词】DNA填充;显微注射;口吸管;微量上样器 【中图分类号】R一33【文献标识码】A【文章编号】 1671—7856[2007)08一$25.02 AConvenientandEconomicalMethodforFillingDNAintoMicroinjectionCapillary FANChang-fa,ZUOQin’,LIBan-wen,LIBo2.YUEBing—fei (1.LaboratoryAnimalCenter,NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts.Beijing100050,China;2.National CenterforSafetyEvaluationofDrugs,NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts,Beijng10(1(160) 【Abstract】 AconvenientandeconomicalmethodforfillingDNAintomicminjectioncapillarywasdescribed.Mouth pipettethatwasusuallyusedforzygotescollectionandtransferwasmodifiedforDNAfilling.DNAsolutionwaspipettedintoa modifiedmouthpipetteandtheninjectedintomicroinjectioncapillaryfromthetailend.DNAfillingcanbefinishedefficiently witIIin2,5rain. 【Keywords】DNAfilling;Micminjection;Mouthpipette;Micmloader 从效率,可靠性等多方面考查,显微注射法是制 备转基因动物的首选方法.目前,大多数转基因动 物是通过该法制作成功的.但该方法技术含量高, 操作比较复杂,它不但需要昂贵的仪器设备,还需要 精细的胚胎操作技术:如采集受精卵,显微注射,注 射后胚胎的移植等.其中,显微注射是最为关键的 步骤之一. 在显微注射过程中,首先需要将DNA溶液填充 到显微注射针(microinjectioncapillary)内.文献报道 一 般采用直接吸取法,即把DNA溶液加于培养皿 中,调节注射控制旋钮吸入DNA溶液.由于显微注 射针尖极细,口径在0.5ttm以下,吸取足量的DNA 溶液往往需要1,2h,非常耗时.另一种较快的方 法是虹吸法.即将DNA溶液加载于显微注射针尾 端,通过虹吸作用,DNA溶液缓慢到达注射针尖端. 该方法较前者快很多,但根据我们的实际操作,注入 0.5ttL也需要15—30min,仍然很耗时.本文介绍 一 种方法,采用稍加改进的口吸管(mouthpipette) 吸取DNA溶液,直接从尾端加入到显微注射针中, 可以在2,5min完成DNA填充. 1材料和方法 1.1材料与仪器 口吸管由吸嘴,软硅胶管和略加改造的巴斯德 吸管组成(图1).拉制移卵管的玻璃管为普通100 采血毛细管,制成后本文称为微量上样器 (microloader).显微注射针由日本Narishige公司的 带芯玻璃毛细管(GDC一1)拉制而成,拉针仪为该公 【作者简介】范昌发(1970一),博士,副研究员.E-mail:fchangfa@hotmail.com. 【通讯作者】岳秉飞.男,研究员,电话:67678484. S26中国比较医学杂志2007年8月第17卷第8期ChinJCompMed.August2007?Vol-17?No?8 司的PC.10puller. 图1用于DNA填充的口吸管全套装置包括吸嘴,硅 胶管,巴斯德吸管及微量上样器. Fig.1ThemouthpoipetteusedtofillingDNA 1.2方法 (1)显微注射针的制作按仪器说明书进行;(2) 取一根采血毛细管,用酒精灯加热后拉至合适长度, 在拉开部分截断毛细管,长度约为10cM(图2),并 略煅烧截断处,使断口变圆滑,以减少对DNA的切 割;(3)将制作好的微量上样器与口吸管连接(图 1),并吸取适量的DNA溶液至微量上样器;如果需 要定量,可先吸取一定量的DNA溶液至EP管中,然 后悉数吸入微量上样器;(4)左手握显微注射针,右 手控制口吸管,并把吸嘴衔在嘴里,保持微量上样器 与显微注射针平行;(5)将微量上样器插入显微注 射尾端,并平稳推进,直至到达注射针尖端(注意控 制,否则可能折断微量上样器,图3);(6)轻轻吹出 DNA溶液,同时将微量上样器缓慢退出,退出过程 中保持微量上样器尖端没于DNA溶液中,以充分排 除气泡. 图2微量上样器及填充好的显微注射针 Fig.2Themicroloaderandanalreadypreparedmicroinjection’ capillary 微量上样器先端较长,可达10em,这样才能抵 达显微注射针尖端.长达8em的显微注射针可以 迅速填充,而且可完全排除气泡.一般情况下,为了 节约DNA样品,填充1.5L即可注射20,30个受 精卵,蓝色代DNA溶液.将微量上样器从显微注 射针尾端插入,平稳推进至注射针尖端,缓缓吹出 DNA溶液,并逐步退出微量上样器.退出过程中保 持微量上样器尖端没于DNA溶液中,以充分排除气 泡,阴影代表DNA溶液. 图3通过微量上样器将DNA溶液填充至显微注射针 Fig.3DNAisfilledintothemicroinjectioncapillaryviathe microloader 2结果与讨论 2.1本法填充迅速,重复性好 通过本方法可迅速地将DNA溶液填充至注射 针中.基于我们的操作,一般可在2,5min内完 成,比采用直接吸取法或者虹吸法都快得多,而且重 复性好,可靠.即使是将8cm长的注射针全部填满 (需l0LDNA溶液,一般注射1.5L即可),也仅 需3min.不难想象,采用直接吸取法或者虹吸法填 充几乎不可能.只要操作得当,可以完全排除注射 针中的气泡(图2).此外,本法还可用于回收注射 针中剩余的DNA溶液. 2.2装置成本低廉,可自己制作 本法所用的DNA溶液填充装置与常规用于收 集受精卯的口吸管无本质区别,制作方法也基本相 同.只是微量上样器前端较长,因为足够的长度才 能抵达显微注射针尖;前端外径不能大于显微注射 针的内径,否则不能插入.Eppendorf公司有一种特 制的微量上样器(Microloader,Cat.930001007)可用 于DNA溶液的填充,但成本很高($l30/200支),一 次性使用.有国外的公司还将类似的微量上样器申 请了专利,其价格也很高.而本法采用略改进的口 吸管完成这一操作,十分省事. 2.3本法有助于加快实验进程 显微注射操作实验周期较长,从超排卵到显微 注射需要4d的准备时间,而最佳的显微注射时间 (前核显现时间)仅仅2,3h.显微注射过程中往 往会遇到注射针折断,堵塞,被细胞内容物包裹,钝 化等多种意外情况,任一种意外发生后都无法正常 进行显微注射,唯一的解决就是更换注射针,也 就需要重新填充DNA溶液.采用传统的直接吸取 法或者虹吸法填充,均需要很长的时间.这很可能 导致错过最佳的显微注射时间,耽误一个实验周期. 而采用本法填充,可节省宝贵的最佳注射时间,加快 实验进程.