柚木愈伤组织的EHA105转化条件

柚木愈伤组织的EHA105转化条件 柚木愈伤组织的EHA105转化条件 福建林学院2007,27(4):349—354 Journa1.ofFujianCollegeofForestry 第27卷第4期 2007年10月 柚木愈伤组织的EHA105转化条件 曾炳山,裘珍飞,李湘阳,刘英 (中国林业科学研究院热带林业研究所,广州龙洞510520) 摘要:对农杆菌EHA105转化柚木愈伤组织的适宜条件进行了优化.EHA105转化柚木愈伤组 织的适宜预培养时间为l1—13d,菌液光密度D600为0.4一O.5,共培养时间为7—9d,共培 养的pH为6.0—6.2.EHA105共培养对柚木愈伤组织有一定的毒害作用,共培养时间超过1O d,可导致愈伤组织和茎段外植体的严重死亡.不同无性系对EHA105侵染的敏感性不一样, 选择适宜的无性系可显着提高转化效率. 关键词:柚木;农杆菌;愈伤组织;遗传转化 中图分类号:Q943.I文献标识码:A文章编号:1001—389X(2007)04—0349—06 Genetictransformationofteakcallusmediatedby AgrobacteriumtumefeciensstrainEHA105 ZENGBing—shan,QIUZhenffei,LIXiang—yang,LIUYing (TheResearchInstituteofTropicalForestry,Guangzhou,Guangdong510520,China) Abstract:ThegenetictransformationofteakcallusmediatedbyAgrobacteriumtumefeciens strainEHA105wasdiscussed.The optimumpre-culturetimeforcallusinductionofstemsectionexplantsis11to13days,D60ova lueofbacteriuminoculumsolution isbetween0.4to0.5,co-culturetimeis7to9daysandpHvalueofco-culturemediumis6.0to6.2 .TheinfectionofEHA105is toxictoexplantsandtherewillbehishdeathrateofexplantsiftheco-culturetimeislongerthan 10days.Differentcloneshave differentsusceptibilitytotheinfectionofEHA105andcloneswithhishsusceptibilityshould beselectedSOthatthetransformation efficiencyofteakcanbegreatlyimproved Keywords:Tectonagrandis;Agrobacteriumtumefeciens;callus;genetictransformation. 柚木(TectonagrandisL.f.)是世界着名的热带珍贵用材树种,生长迅速且材质优良,广泛用于造船, 桥梁,建筑,高级家具,高档车厢,雕刻,贴面板和镶贴板等】.柚木也是我国热带地区的主要造林 和经济树种,我国9省60多个县(市)有引种栽培,总面积约2万多hm2L2】. 我国的柚木栽培经常受到土壤酸性,低温冻害,锈病,台风,野螟等问题的困扰J,必须加强常 规育种,选育适合于各种立地条件的种源,家系和无性系.同时,在常规育种的基础上,开发柚木 的转基因技术,研制抗寒,抗虫,抗病,速生的转基因新品种,对于我国柚木的推广栽培也具有重要意 义.从叶盘,茎段,胚轴,子叶等外植体上诱导愈伤组织,转化愈伤组织,并再生出转基因植株一直以 来是植物转基因的重要方法.本文优化了柚木茎段愈伤组织的农杆菌转化条件,为柚木转基因技术研究 和转基因育种奠定基础. 1材料与方法 1.1试验材料 采用无性系试管苗的茎段进行愈伤组织诱导,以愈伤组织连同茎段一起做外植体进行转基因参数的 优化.农杆菌则采用含有双元载体pTiBO542和pBI121的常用菌株EHA105. 基金项目:中国林业科学研究院科学基金资助项目(0186110). 作者筒介:曾炳山(1969一),男,江西井冈山人,副研究员,从事林木组培快繁和基因转化研究. 收稿日期:2007—04—17;修回日期:2007—07—24. 350福建林学院第27卷 1.2试验方法 1.2.1愈伤组织诱导取具有4—5对叶片,高度为6—8cm的无菌试管苗,切取长度为1.2—1.5cm,不 带腋芽的茎段,平放在MS+BA0.5Jl】g?L的培养基面,于26—28?诱导茎段的两端产生愈伤组织. 1.2.2农杆茵培养先从一80?低温冰箱中取出保存的农杆菌,涂LB培养基平板,挑取单菌落,进 行2mL的小体积LB液体培养,再按1:40的比例接种,进行100mL的大体积液体培养繁殖工程农杆 菌】.平板培养基和液体培养基附加50mg?L的卡那霉素.平板培养,液体培养,共培养的温度均为 25—27?.液体培养的转速为180r?min,.以4000r?min离心收集农杆菌,并用柚木愈伤组织诱导 的液体培养基重新悬浮,再用于接种和共培养. 1.2.3试验设计预培养时间试验设置7,9,11,13,15,17d6种处理;共培养时间试验设置3, 5,7,9,11d5种处理;共培养pH试验设置6.2,6.0,5.8,5.6,5.4,5.2,5.0七种处理;菌液光 密度试验设置0.3—0.4,0.4—0.5,0.5—0.6,0.6—0.7,0.7—0.8,0.8—0.9六种光密度处理,因 菌液光密度难以控制且测定光密度烦琐费时,实际处理的光密度略有偏离试验设计.采用7813,7557, 108和8301四个无性系进行农杆菌转化敏感性测定.外植体取材部位试验选取每个芽苗最长的3节, 分上,中,下3种部位处理进行试验.接种时间试验设置浸泡5,15,25和35min4种处理.卡那霉素 试验设置O,5,10,15,20,25mg?L6种处理. 1.2.4试验重复所有试验的每个处理重复8瓶,每瓶6个茎段,共48个重复.由于实际操作中存在 一 定的污染率,每个处理比预定的重复瓶数增加2—3瓶,以确保每个处理到调查时有足够的瓶数.如 果没有污染,多余的瓶数则随机去除. 1.2.5GUS染色与显微观察参照文献[9]的方法,预培养和共培养结束后即进行GUS染色,染色温 度为37?,时间为24h.染色后,无水酒精褪色48h,每12h换1次新鲜酒精.在实体显微镜下放大 40倍观察,统计蓝斑的数量. 1.2.6试验观测调查指标有愈伤组织蓝斑数,茎段表皮蓝斑数,愈伤组织颜色,愈伤组织重量,愈 伤组织死亡率和茎段外植体死亡率等.正常的柚木愈伤组织为白色,淡绿色或淡黄色,愈伤组织变成黑 褐色和水浸状时视为死亡.正常茎段的表皮颜色为绿色或淡绿色,茎段变成深黄色或褐色时视为死亡. 2结果与分析 2.1预培养时间 外植体预培养时间是农杆菌转化植物细胞的重要技术参数之一,预培养使得外植体的细胞处于旺盛 的细胞分裂和生长状态,从而容易被农杆菌转化叫.从表1可以看出,愈伤组织的蓝斑数量从预培养7d 的3.3个?茎段一,逐渐增加至11d的9.33个?茎段,,13d的蓝斑数量达到最大值,而超过15d,蓝 斑数量呈下降趋势.EHA105转化柚木愈伤组织时以预培养11—13d为佳.愈伤组 织的有斑率从7d的 26.67%升至11d的53.33%后则基本稳定在52.0%一53.2%. 表1不同预培养时间EHA105对108愈伤组织的转化效率 Table1Trans~ormationefficiencyofEHA105to108cloneBcallusatdifferentpre~cultureti me 第4期曾炳山等:柚木愈伤组织的EHA105转化条件351 除转化愈伤组织外,EHA105还转化茎段的表皮细胞,平均每个茎段的表皮蓝斑数为1.53—3.57 个.随着预培养时间的增长,茎段表皮细胞的转化效率呈明显下降趋势,可能是茎段的内部营养逐渐用 于形成愈伤组织,活力逐渐下降的缘故.共培养过程中,也发现随着预培养时间的延长和愈伤组织的萌 发与增大,茎段表皮由绿色逐渐转变为淡绿色或浅黄色. 2.2接种时间 接种浸泡时间过短,农杆菌尚未接触或接种到外植体表面,共培养时无农杆菌生长,不能转化.接种 浸泡时间过长,外植体常因农杆菌毒害而软腐.EHA105转化7552愈伤组织时,接种时间为5—25rain, 愈伤组织的蓝斑数量逐步提高.因此,适宜于柚木愈伤组织转化的接种时间约为25min. 表2不同接种时间EHA105对7552愈伤组织的转化效率 Table2TransformationefficiencyofEHA105to7552clone8callusatdifferentinoculationti me 2.3共培养时间 共培养时间也是农杆菌转化植物细胞的重要技术参数之一.农杆菌接受植物信号,切下T—DNA, 包装T—DNA,穿过植物细胞壁和细胞膜,通过细胞质进入细胞核,并整合到染色体上至少需要16hl8]. 因细胞结构的差异,释放的受伤信号强弱不同,忍受农杆菌危害的能力不同,不同植物最适宜的共培养时 间差异比较大.7557愈伤组织与EHA105共培养的时间少于5d时,愈伤组织蓝斑数低于0.5个?茎段,, 共培养9d时愈伤组织蓝斑数升至最大值,但超过lld蓝斑数量开始下降.因此共培养天数以7—9d 为好,茎段愈伤组织蓝斑数量最多,愈伤组织有蓝斑的百分率也最高.农杆菌EHA105对茎段表皮细胞 的转化也需要5d以上,3d共培养时间则茎段表皮极少有蓝斑. 表3不同共培养时间EHA105对7557愈伤组织的转化效率 Table3TranfformationefficiencyofEHAI~to7557done8callusatd~erentc0一culturetime 共培养时间过长,农杆菌过度生长,植物细胞因遭受农杆菌毒害而死亡.7557茎段与EHA105共培养 5d,愈伤组织即有6.3%的死亡率,茎段死亡率为12.5%,共培养10d后愈伤组织死亡率达到12.3%, 茎段死亡率达到17.9%,共培养15d后愈伤组织死亡率达到28.1%,茎段死亡率则高达50.O%.因此, EHA105的生长和侵染对柚木愈伤组织和茎段具有一定的毒性,共培养时间应少于10d. 2.4共培养pH EHA105对7813无性系愈伤组织的转化效率随pH值的减小而降低,pH值低于5.6时转化效率显 着下降.茎段愈伤组织蓝斑数的方差分析结果显示,pH值为6.0—6.2差异不显着,但显着高于pH值 为5.0—5.6.因此,适宜于EHA105转化柚木愈伤组织的共培养pH为6.0—6.2.EHA105对茎段表皮 细胞转化则需要低的pH值为5.0—5.4.适宜于EHA105转化表皮细胞的pH值与转化愈伤组织的pH 值有明显的差异. 352福建林学院,第27卷 2.5菌液光密度 处于对数生长期的农杆菌转化效率最高,但对数生长初期的菌液浓度比较小,农杆菌个体数量不 足.光密度是菌液浓度的最好指标,当菌液光密度D鲫小于0.3时,农杆菌个体数量不足.光密度超 过1.0后,培养基的养分和氧气供应不足,农杆菌菌液中死亡个体的比例增加,多数情况下不适宜于转 化L8J.EHA105转化7552的结果表明,光密度为0.392—0.505,茎段愈伤平均蓝斑数比较高,愈伤组 织有蓝斑率也高,为适宜的菌液浓度范围.茎段表皮细胞的转化率则在光密度为0.392—0.685均比较 高. 表5不同光密度D鲫EHA105对7522愈伤组织的转化效率 Table5TransformationefficiencyofERA105to7552clonescallusatdifferentD6co?皿values 2.6无性系与取材部位 不同基因型或无性系对农杆菌的侵染具有不同的敏感性.EHA105对7813,108和7531三个无性系 愈伤组织具有较高的转化效率,而茎段表皮细胞的转化频率则比较低.与其它3个无性系相反,7557 愈伤组织的转化效率低,而茎段表皮细胞的转化效率高,蓝斑数量显着高于其它3个无性系.因此,不 同无性系对农杆菌的侵染和转化有不同的敏感性,应选择敏感的无性系开展柚木转基因研究. 表6EHA105对不同无性系愈伤组织的转化效率 Table6TransformationefficiencyofEHA105tocallusofdifferentclones 第4期曾炳山等:柚木愈伤组织的EHA105转化条件353 柚木组培苗的个体比较大,高度可达7—8cm,节数4—5个.中间3节的长度最大,占整个苗木高 度的85%以上.选取每个芽苗最长3节进行转化,结果表明,上,中,下3节的愈伤诱导率,愈伤组 织转化率和茎段表皮细胞转化率均有明显的变化趋势. 上部茎段容易诱导出愈伤组织,两端的愈伤组织诱导率均比中,下部茎段高,下部茎段两端的愈伤 组织诱导率均最低.另外,3种茎段均容易在基部方向的下端形成愈伤组织,下端的愈伤组织诱导率为 67.5%,而上端则仅有31.66%.茎段取材部位对转化效率的影响趋势也比较明显.上部茎段的愈伤因 诱导率,愈伤组织转化率,平均蓝斑数均最高,中部茎段居中,下部茎段最低.然而,表皮细胞的转化 效率却相反,下部茎段最高,上部茎段最低. 3讨论 在植物外植体的转化过程中,共培养时间长,农杆菌过度生长会对植物细胞产生毒害作用导致植 物组织的死亡和转化效率的降低.水稻,棉花,马铃薯,黄瓜,西瓜,甜瓜,烟草,甘薯,苜蓿,亚 麻,花生,豌豆,生菜等许多农作物的最适共培养时间为2—6dJ,桉树,木麻黄,杨树,白桦等多 数林木也是3—6d卜].柚木愈伤组织对农杆菌的过度生长和毒害具有一定的耐性,与EHA105共培 养的适宜时间为7—9d,比常见植物种类的2—6d多2—3d. pH值对农杆菌陆区基因的活化和表达有显着的影响,当培养基的pH低于6.0时比较适宜于农杆 菌基因的诱导表达,pH值为5.1—5.8时基因的诱导达到最高水平J.柚木是一种不耐酸性的 树种,土壤的pH值为6.5左右时最适宜于生长_4】.柚木外植体的愈伤组织诱导和增殖培养适宜的培 养基pH值也比较高,为6.0—6.4.因此,选择合适的共培养pH值,既满足农杆菌区基因活化的 要求,又适宜于愈伤组织的生长成了转化条件优化的关键之一.研究结果表明,柚木愈伤组织的转化效 率随pH值的减小而降低,pH值低于5.6时转化效率显着下降,适宜于EHA105转化愈伤组织的共培养 pH值为6.0—6.2,比其它植物种类要求的6.0以下略高j. 多数林木的再生频率低,严重影响了遗传转化研究,即使有些林木种类的再生频率比较高,但却仅 限于幼胚,子叶,上胚轴,下胚轴等幼嫩的外植体.林木育种多是走无性系育种的道路,栽培上使用的 良种绝大多数是无性系.用幼胚,子叶,上胚轴,下胚轴等有性材料进行转基因育种,无法保持无性系 的所有优良特性.因此,现有转基因技术还无法直接在常规育种的基础上进行转基因育种.对于柚木而 言,愈伤组织的再生效率非常低,只有来自茎段的愈伤组织能够以器官再生的形式低频率地再生,因而 本研究选择来源于茎段的愈伤进行转基因条件的优化.王关林等认为,由于植物基因转化的频率较 低,一般情况下只有0.1%的转化率,而且农杆菌的侵染,抗生素的筛选等转基因操作,可使再生效率 进一步降低,甚至完全不能再生,因此受体系统必须具有高频的再生率,最好大于90%.贾士荣[1'也 认为,用于基因转化的受体系统应该具有80%一90%的再生频率,并且每块外植体能再生出丛芽.目 前柚木外植体的再生率低,再生配方有待于进一步优化,只有达到一定的再生频率,才能保证转基因的 效率,否则难以获得足够数量的柚木转基因植株. 致谢:本研究的无性系材料由热带林业研究所的梁坤南研究员提供,特此致谢. 参考文献: [1]周铁烽.中国热带主要经济树木栽培技术[J].北京:林业出版社,2001 354福建林学院第27卷 [2]马华明,梁坤南,周再知.我国柚木的研究与发展[J].林业科学研究,2003,16(6):768—773. 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