中药复方及单味药材中淫羊藿苷的大鼠体内药

中药复方及单味药材中淫羊藿苷的大鼠体内药 中药复方及单味药材中淫羊藿苷的大鼠 体内药 摘要] 目的:利用反相高效液相色谱法,分别比较复方与单味药材提取物中淫羊藿苷在大鼠体内的药代动力学(药动学)参数差别,探讨配伍对药效成分体内过程的影响。方法:实验大鼠分别灌胃复方及单味药材提取物后,测定不同时间点血浆中淫羊藿苷的浓度,采用药动学程序3P97对数据进行统计学处理,进行药动学模型拟合并计算相关药代动力学参数。结果:复方及单味药材中淫羊藿苷在大鼠体内分别呈二室和一室模型,主要药代动力学参数为:复方组Cmax=(3.133?0.290) μg/ml,t1/2(Ka)=(0.753?0.809) h,Tmax=(2.089?0.144) h,AUC0- 24=(30.839?3.680) μg?h/ml。单味药材组Cmax=(2.318?0.218) μg/ml,Tmax=(1.497?0.521) h,AUC0-24=(19.947?2.555) μg?h/ml。结论:与单味药材相比,复方中淫羊藿苷在大鼠体内吸收增加、消除及达峰时间延长、血浆清除率减少,因此复方配伍对淫羊藿苷体内过程有显著影响。 [关键词] 药代动力学;淫羊藿;淫羊藿苷;HPLC 复方肝康颗粒(以下简称为“复方”)是在“乙肝汤剂”的 基础上，经过拆方解方和剂型研究改进而来，长期临床疗效明，该复方能明显改善慢性乙肝患者的症状和体征，具有 护肝和抗病毒的作用口1。淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分。 是一种分子式为C H 0()， 的异戊烯基黄酮醇苷类化合物。近年来的研究表明，淫羊藿苷具有多方面药理作用。主要包括: 心血管方面，在降低心肌耗氧量的同时降低外周阻力，减轻心脏后负荷，对心肌缺血和心律失常等心血管疾病有改善作 用[21，扩张血管平滑肌，改善微循环，对脑部缺血、低氧有保护 作用;内分泌方面表现为性激素样作用，具有补肾壮阳作用; 促进体外培养成骨细胞增殖和分化;能增强免疫功能，起到免疫调节作用，抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡13l，还具有延缓 衰老、抗疲劳和耐低氧作用，促进蛋白质合成与核酸代谢，对肝细胞具有保护作用 。 1试验材料 1(1仪器 北京西东电子高效液相色谱仪LC5500(SPD一10A VP紫 外检测器。LC—IOAT VP泵，CBM一102 Communication Bus Module工作站，HT一230A柱温箱);WH一2微型漩涡混合仪 (上海沪西仪器厂有限公司);TGL16M 高速冷冻离心机 (长沙英泰仪器有限公司);AFX2—1001一P艾科浦超纯水系 统(重庆颐洋企业发展有限公司);HZ一9811K双层双速振荡 器(上海康华生化仪器制造厂);CH1050超级恒温槽(上海恒平科学仪器有限公司);SKG一02400电热恒温干燥箱(黄石市 恒丰医疗器械有限公司);XS105 DualRange万分之一电子天 平(ME1]【’LER TOLEDO，瑞士);BCD一179K Haier冰箱。 1(2试药 复方肝康颗粒(批号为060305)，复方所用药材及淫羊 藿(均购自邵阳药材公司，淫羊藿批号为070208)，淫羊藿药 材提取物(自制);淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110737—200312);苯甲酸对照品(中国药品生物 制品检定所，批号为100419—200301);肝素钠(南京新百药业有限公司);乙腈(美国TEDIA公司，色谱纯);冰醋酸(天津化学试剂有限公司，分析纯);乙酸乙酯(天津化学试剂有限公司，分析纯);甲醇(天津化学试剂有限公司，分析纯);重 蒸水(自制)。 1(3试验动物 健康SD大鼠，雄性，体重(200~20)g，由湖南环境生物 学院医学部实验动物中心提供，动物自由摄食自来水和普通 饲料。 2方法与结果 2(1方法 2(1(1色谱条件色谱柱为Shim-packVP-ODS(4(6mmxl50mm。 5(0 m)，流动相为乙腈一3,醋酸(30:70)，检测波长为 270 nm，流速为1(0 ml,min，内标为苯甲酸，柱温为室温，进 样量为20 1。 2(1(2血浆样品的处理方法大鼠灌胃前尾静脉取血1 ml置 于预先肝素化的试管中，离心(3 000 r,rain，10 min)，取上层 血浆作为空白血浆;取3份空白血浆样品0(5 ml于10 IIll具 塞离心管中，加入同浓度的淫羊藿苷对照品溶液100 漩 涡混合均匀，分别比较乙酸乙酯萃取、甲醇和乙腈沉淀法的色谱图和回收率，最后确定使用乙酸乙酯萃取法处理。 具体步骤如下:取样品加入2(5 Il1l乙酸乙酯。振荡萃取 3 rain，离心(5 000 r,min，5 min)，移取上清液，于37?水浴氮 气吹干，残渣加入100 l甲醇漩涡振荡1 min溶解，高速离 心(10 000 r,min，2 min)，取上清液20 l进样。 2(1(3药动学研究取SD大鼠110只。随机分为22组。每组 5只，其中，11组给予复方，另11组给予淫羊藿提取物。实验 前禁食(不禁水)12 h，第2天按体重灌胃给予复方(4(30 g，kg) 和淫羊藿提取物[1(64 g(生药),kgl，相当于淫羊藿苷4(36 ms,ks， 灌胃后于0(25、0(50、0(75、1(00、1(50、2(00、4(00、6(00、8(00、12(00、 24(00 h尾静脉采血1 ml，置于预先肝素化的试管中，离心(3 000 r,min，10 min)，取上层血浆0(5 ml放入一20?冰箱保存备用，每个时间点取5只大鼠。按“2(1(2”项下的方法处理后测 定。 2(2分析方法验证 2(2(1系统适用性试验理论塔板数按淫羊藿苷计算不小于 3 000，该峰与其相邻色谱峰的分离度大于1(5，对称因子小 于1(O50 2(2(2方法专属性0(5 ml空白血浆不加样(0(5 ml空白血浆 中加入淫羊藿苷和内标物苯甲酸品及0(5 ml给药后大 鼠血浆，按照“2(1(2”项下方法处理血浆样品后，分别观察其色谱行为(结果表明血浆中内源性物质不干扰淫羊藿苷和内 标物的测定。并且二者峰形良好。淫羊藿苷和内标物苯甲酸的保留时间分别为7(1、5(8 min，见图1。 2(2I3标准工作曲线及最低检测限测定分别精密量取淫羊藿苷贮备液适量(用甲醇稀释制成10(200 0、5(100 0、1(020 0、 0(510 0、0(255 0、0(128 0、0(063 8 咖l的淫羊藿苷系列对照品溶液。于4~C保存备用。 标准工作曲线的绘制:取500 空白血浆7份，分别加入不同浓度的淫羊藿苷系列对照品溶液100 Ixl及内标溶液 50 1，漩涡振荡混匀后，按“2(1(2”项下操作，分别色谱 图。以淫羊藿苷与内标物的峰面积比值为纵坐标(Y)，淫羊藿苷浓度为横坐标( ，l~g,m1)作图进行线性回归，得标准 曲线和回归方程为Y=0(041 3X+0(000 6(r=0(999 7，表明淫 羊藿苷在0(063 8-10(200 0~g,ml范围内线性良好。以信噪比S,N?3时的浓度为最低检测浓度，得方法定量限为 0(063 8 I~g,ml。 2(2(4精密度试验分别取空白血浆500 Ixl。精密加入高、中、 低3个浓度(浓度分别为l0(20、5(10、O(51 g，rn1)的淫羊藿苷标准品100 1，同时加入5O l内标溶液，按“2(1(2”项下 处理，每一浓度进行6个样本分析，连续测定3 d，与标准工 作曲线同时进行血浆样品的浓度计算，求得方法的日内与日间精密度RSD。日内RSD分别为2(33,、3(11,、2(42,;日间 5 分别为3-36,、1(98,、2(75,。 2I2(5提取回收率分别取空白血浆500 l，精密加入高、中、 低3个浓度(浓度分别为10(2O、5(10、0(51~g,m1)的淫羊藿苷标准品100 l，每个浓度各6样本，按“2(1(2”项下操作， 测得血浆样品浓度。以样品经提取后的色谱峰面积与未经提取直接进样获得的色谱峰面积之比(考察样品的提取回 收率及其兄。高、中、低3个浓度的回收率分别为93(88,、 90(82,、87(42,;RSD分别为2(17,、lI49,、1(84,。 2(2(6稳定性试验取空白血浆500 txl，精密加入高、中、低 3个浓度(浓度分别为10(2O、5(10、0(51 g,m1)的淫羊藿苷标准品100 1及内标溶液50 ，每个浓度各6样本， 按“2(1(2”项下操作，进样20 l记录样品的峰面积，剩余样本置于室温保存(约28oC)，于6、12、24 h后重新测定， 将3个浓度各时间点测得的峰面积比进行对照，计算 RSD(,)。测得10(20、5(10、0(51~glml样品的RSD分别为 2(43,、5(36,、7(73,。实验结果表明，血浆样品经处理于室温保存24 h后，血浆中淫羊藿苷浓度仍可被准确测 定。 2(3药动学研究结果 将测得的血药浓度数据采用3P9 实验药动学计算机程 序，对血药浓度一时问数据进行拟合，根据AIC最小的原则选 取房室模型，两组闻的药动学参数比较采用两样本总体均数 t检验。复方及淫羊藿中淫羊藿苷在大鼠体内分别呈二室和 一室模型，主要药代动力学参数见表l，其平均药一时曲线见 图2。 3讨论 3(1血浆样品的处理 先后采用乙酸乙酯萃取。甲醇、乙腈沉淀来处理样品，发 现与甲醇和乙腈沉淀处理相比，用乙酸乙酯处理的样品所含内源性干扰物少(样品的回收率较高(结果与文献报道 一致，有研究者曾用甲醇提取获得了理想的结果罔，但使用甲醇 沉淀易出现乳化现象。对乙酸乙酯使用量和萃取次数的考察中，曾用0(5 ml血浆加入1(5、2(5、3(0 IIll进行1次及2次萃取，结果发现，用2(5 rIIl及3(0 ml的提取率高于1(5 IIll，但 2(5 IIll与3 Hl1之间几无差别，分1次和2次萃取提取率差别不大，因此选用乙酸乙酯1次萃取。既方便又节省溶剂且挥 干时间较短。经方法学证实，该方法确有较高的灵敏度和专属性，以及良好的精密度和准确度，符合生物样品分析方法 的要求。 3(2淫羊藿苷的药动学特点 各时间点血药浓度数据经3P97药动学软件拟合分析 后，得出复方中淫羊藿苷在大鼠体内均呈二室模型，淫羊藿提取物中淫羊藿苷在大鼠体内呈一室模型。药动学参数分 析:复方和淫羊藿提取物大鼠灌胃后。淫羊藿苷在大鼠体内的吸收滞后时间(Lag time)分别为0(347、0(271 h。动物给药后复方组吸收入血的速度较慢;两组药物的吸收速率常数l(1 分别为1(119、2(192，说明淫羊藿提取物组吸收的速度较快，而复方组吸收的速度较慢;两组消除半衰期比较，服用复方 组动物体内的淫羊藿苷消除相对较慢;血浆药物峰浓度( ) 分别3(133、2(318，曲线下面积 uc)值分别为30(839、19(947，复方组的吸收程度较淫羊藿提取物组好;血浆清除率(CL)、 表观分布容积(Vd)。淫羊藿提取物组相对较大。两组间的差 别经t检验得出，Cl腽、AUC、CL、Vd、疋、t (P<0(O1)， (P< 0(05)，说明复方与淫羊藿提取物的 存在显著性差异，在 Cm、AUC、CL、 、疋、‘I傩 之间有非常显著性差异。此结果显示。复方中淫羊藿苷在大鼠体内较淫羊藿提取物的吸收明显 增加，药物峰浓度增高，消除及达峰时间延长，血浆清除减少，药物体内作用的时间延长，单味药提取中的淫羊藿苷体 内分布较广。据文献报道，淫羊藿苷的生物利用度仅为12, ，随着灌胃剂量的增加，并不能明显提高其血药浓度，且吸收 情况较差，原因可能是由于高剂量时淫羊藿苷的溶解度降低，药物难以经胃肠道吸收。赵艳红等[10-11研究了淫羊藿苷大 鼠肠内吸收的机制，表明淫羊藿苷先被水解再吸收，高剂量灌流时有少部分以原型形式吸收;另有学者[121将淫羊藿总黄 酮制成磷脂分散物后(使淫羊藿苷在大鼠体内的吸收增加，药时曲线下积分面积似wc)提高2(5倍，峰浓度提高3倍。本 研究的结果表明通过改变剂型，增加总黄酮的溶解，提高亲脂性，将有效提高淫羊藿苷在体内的吸收，由此推测复方本 身存在，或是在煎煮制备的过程中产生了某些新成分，这些成分与淫羊藿苷作用后。增加了淫羊藿苷的溶解度及亲脂 性，使得其在大鼠体内的吸收增加，生物利用度提高，具有协同增效的作用。 上述研究证明(中药复方成分在体内的变化是一个复杂 的过程。复方中各成分对淫羊藿苷在体内有促进吸收、协同增效的作用。同时进一步证实了中药复方配伍应用的科学性所在。 杜仲提取物 绿原酸 金银花提取物 苦杏仁苷 枇杷叶提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科罗索酸 淫羊藿苷 二氢杨梅素 獐牙菜苦苷 杨梅素 10-羟基喜树碱 7-乙基-10羟基喜树碱 上禾生物 专注植提 精于高纯 基于您对天然产物需求持续创新 产品购买:138-7585-5783