细胞壁代谢指标测定

细胞壁代谢指标测定 1粗纤维的测定(GB/T5009.10---2003) 1.原理 在硫酸作用下，水解除去果蔬中的糖、淀粉、果胶物质和一些半纤维素，再用碱处理出去样品中的蛋白质及脂肪酸，遗留的残渣即为粗纤维。 2.仪器及用具 三角瓶、古氏坩埚、亚麻布 3.试剂 1)1.25%硫酸，12.5g/L氢氧化钾溶液 ，酚酞指示剂 2)甲基红指示剂 称取0.1g甲基红溶于100ml60%乙醇中。 3)石棉 加50g/L氢氧化钠溶液浸泡石棉，在水浴上回流8h以上，再用热水充分洗涤。然后用20%盐酸在沸水浴上回流8h，再用热水充分洗涤，干燥。在600-700?下灼烧后，加水使成混悬物，贮存于带塞玻璃瓶中。 4.实验步骤 1)样品酸处理 称取10.0g样品，加入少量1.25%硫酸溶液研磨成匀浆后转入500ml三角瓶中，加入0.5g石棉和200ml煮沸的1.25%硫酸，加热使微沸，并立即链接回流冷凝管以保持体积恒定，维持30min，每隔5min将锥形瓶轻轻振荡一次，以充分混合瓶内的物质，避免样品附着在液面以上的瓶壁上。加热完毕后，立即用亚麻布过滤，用沸水洗涤残渣至洗液不呈酸性(以甲基红为指示剂)。 2)样品碱处理 用200ml煮沸的12.5g/L氢氧化钾溶液，将亚麻布上的残留物洗入原三角瓶内，接上回流冷凝管，加热微沸30min后，取下三角瓶，立即用亚麻布过滤，以沸水洗涤2-3次至洗液不呈碱性(以酚酞为指示剂)。 3)干燥 用水把亚麻布上的残留物洗入100ml烧杯中，然后移入以称重干燥的古氏坩埚中，抽滤，并用热水充分洗涤后，抽干。在依次用乙醇和乙醚各洗涤一次，以出去单宁、色素及残余的脂肪等物质。将坩埚和内容物在105?烘箱中烘干后称量，重复操作，直至恒重(两次称量质量<1mg)。 5.结果计算 粗纤维含量以质量分数(%)表示。 粗纤维含量=G/m*100% G—残余物的质量，;m—样品质量，g。 注:用亚麻布过滤时，最好采用200目尼龙筛绢过滤，既耐较高温度，孔径又稳定，本身不吸水分，洗残渣也较容易。过滤时间不能太长，一般不能超过10min，否则应适量减少称样量。 2纤维素酶活性的测定(Cx)参照曹建康的方法 基本原理:在纤维素酶作用下，纤维素可被逐步水解并最终生成β-葡萄糖。在碱性条件下，纤维素酶催化纤维素水解的产物纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3,5—二硝基水杨酸(DNS)还原。通过测定纤维素酶催化形成还原糖的量可测定纤维素酶的活性。 材料、仪器及试剂: 1.仪器及用具:恒温水浴锅、分光光度计、电子天平、试管、移液管或加液器、具塞刻度试管(25mL)、容量瓶(100mL、1000mL)、烧杯等。 2.试剂: (1)50mmol/L、pH5.5乙酸—乙酸钠缓冲液配制方法 母液A(0.2mol/L乙酸溶液):量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。 母液B(0.2mol/L乙酸钠溶液):称取16.4g无水乙酸钠(或称取27(2g三水合乙酸钠)，用蒸馏水溶解，稀释至1000mL。 取6.8mL母液A和43.2mL母液B混合后，稀释至200mL，即为50mmol/L、pH5.5乙酸—乙酸钠缓冲液。 (2)提取缓冲液(含1.8mol/LNaCl):称取10.5gNaCl，用50mmol/L、pH5.5乙酸—乙酸钠缓冲液溶解，稀释至100mL，摇匀。 (3)50mmol/L、pH5.0柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液 母液A(0.2mol/L柠檬酸溶液):称取42.03gCHO?HO，溶解稀释至l000mL。 6872 母液B(0.2mol/L柠檬酸钠溶液):称取58.82gNaCHO?2HO，溶解稀释至1000mL。 36572 取20.5mL母液A和29.5mL母液B混合，调节pH至5.0，稀释至200mL。 (4)3,5—二硝基水杨酸(DNS)试剂 1)配制500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液。 2)配制262mL的2mol/LNaOH溶液; 3)称取6.3g 3,5—二硝基水杨酸; 4)称取5.g结晶酚; 5)称取5.0g亚硫酸钠; 6)将2)、3)、4)、5)各成分加入到1)中，搅拌，使之溶解。待冷却后，转人到l000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度，贮于棕色瓶中备用。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。 (5)10g/L羧甲基纤维素钠(CMC)溶液 准确称取1.00g羧甲基纤维素钠，用50mmol/L、pH5.0柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液加热溶解后，转移到100mL容量瓶中，待冷却后，用该缓冲液定容至刻度，4?保存备用。 (6)95,乙醇 (7)80,乙醇溶液 (8)1mg/mL葡萄糖液 实验步骤 (一)制作葡萄糖标准曲线 参照DNS试剂测定还原糖实验中的方法制作。 取7支25mL刻度试管，编号，按表1精确加入1mg/mL葡萄糖标准液和3,5—二硝基水杨酸(DNS)试剂。将各管摇匀，在沸水中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL刻度处，摇匀。在540nm波长下，以0号管做空白对照调零，测定吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖质量为横坐标，绘制标准曲线，并求出线性回 归方程。 表1 3,5—二硝基水杨酸(DNS)试剂测定还原性糖绘制葡萄糖标准曲线的试剂量 管号 项目 0 1 2 3 4 5 6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1mg/mL葡萄糖标准液/mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 蒸馏水/mL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 DNS试剂/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 相当于葡萄糖量/mg (二)酶液制备 称取10.0g果蔬样品，置于经预冷的研钵中，加入20mL经预冷的95,乙醇，在冰浴条件下研磨匀浆后，全部转入到离心管中，低温放置10min，然后于4?、12000×g离心20min。倾去上清液，向沉淀物中再加入10mL经预冷的80,乙醇，振荡，低温放置10min，然后在相同条件下离心。再倾去上清液，向沉淀物中加入5mL经预冷的提取缓冲液，于4?放置提取20min，再经过离心后收集上清液即为酶提取液，4?保存备用。 (三)活性测定 取2支25mL刻度试管编号，分别加入1.5mL10g/LCMC溶液。向一支试管中再加0.5mL酶提取液，向另一支试管中加入0.5mL经煮沸5min的酶提取液作为对照，置于37?恒温水浴保温1h。取出后迅速加入1.5mL3,5—二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5min。然后迅速冷却至室温，以蒸馏水稀释至25mL刻度处，混匀。在540nm波长处按照与制作标准曲线相同的方法操作，分别测定各管中溶液的吸光度值。重复三次。 计算结果 根据样品反应管和对照管溶液吸光度值的差值，在标准曲线上查出相应的葡萄糖质量。纤维素酶活性以每小时每克果蔬组织样品(鲜重)在37?催化羧甲基纤维素水解形成还原糖的质量表示，即μg/h?g。计算公式: 式中m’—从标准曲线查得的葡萄糖质量，mg; V—样品提取液总体积，mL; Vs—测定时所取样品提取液体积，mL; t—酶促反应时间，h; m—样品质量，g。 3果胶含量的测定(咔唑比色法) 1.仪器及用具:分光光度计、天平、研钵、容量瓶、具塞刻度试管(25mL)、移液器、三角瓶、水浴锅、计时器、离心机，刻度离心管。 2.试剂 (1)1.5g/L咔唑—乙醇溶液 称取0.15g咔唑加入无水乙醇溶解并稀释至100mL。 (2) 100μg/mL半乳糖醛酸标准液 称取10mg半乳糖醛酸(相对分子质量为194)，用蒸馏水溶解，定容至100mL。 (3)浓硫酸(分析纯) (4)95,乙醇 (5)0.5mol/L硫酸溶液 3.实验步骤 (1)制作标准曲线 取6支25mL具塞刻度试管，编号，按照表1加入半乳糖醛酸标准液，然后小心地沿管壁加入6.0mL浓硫酸，在沸水浴中加热20min，取出冷却至室温后，各加入0.2mL1.5g/L咔唑—乙醇溶液，摇匀。在暗处放置30min后，测定反应液在波长530nm处的吸光度值。以半乳糖醛酸质量(μg)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程。 管 号 项目 0 1 2 3 4 5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 半乳糖醛酸标准液标准液/mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 蒸馏水/mL 0 20 40 60 80 100 相当于半乳糖醛酸质量/µg (2)提取 ?可溶性果胶的提取 称取1.0g果蔬组织样品，置于研钵中研磨成匀浆，转入到50mL刻度离心管中，加入25mL 95,乙醇，在沸水浴上加热30min，以除去样品中糖分及其它物质。注意在煮沸过程中要及时补加95,乙醇溶液。取出冷却至室温后，于8000r/min离心15min,弃去上清液。再加入95,乙醇，在沸水浴上加热。如此重复3,5次。然后将沉淀放人原试管中,加入20ml蒸馏 ?水浴中保温30min，以溶解果胶。取出冷却至室温后,于8000r/min离心15min，水，在50 将上清液移入100mL容量瓶中，用少量水洗涤沉淀，离心后，一并将上清液移人到容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此溶液即为可溶性果胶。 ?原果胶的提取 经蒸馏水洗涤后的沉淀物，仍保留在原刻度离心管中。再向离心管中加入25mL0.5mol/L硫酸溶液，在沸水浴中加热1h以水解原果胶。取出冷却至室温后，于8000r/min离心15min，将上清液移人100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此为原果胶测定液。 (3)测定吸取1.0mL提取液，加入到25mL刻度试管中，按标准曲线的操作步骤进行测定。重复三次。 4.实验结果与计算 根据溶液吸光度值，在标准曲线上查出相应的半乳糖醛酸质量，计算果蔬组织中果胶含量，以生成半乳糖醛酸的质量分数(,)表示。计算公式: 式中m’—从标准曲线查得的半乳糖醛酸质量，μg; m—样品质量，g V—样品提取液总体积，mL; Vs—测定时所取样品提取液体积，mL; 分别按上述公式计算原果胶与可溶性果胶含量。提取液总体积按各自最后定容的体积计算。5.注意事项(1)硫酸的纯度对咔唑的呈色反应有很大的影响，故必须用分析纯的硫酸。 (2)在加入95,乙醇溶液后的几次煮沸过程中，都会造成试管中溶液的挥发损失。在操作过程中，应注意随时观察，及时补加乙醇溶液。 (3)一定要用利用乙醇进行多次蒸煮以完全除去样品中的糖分及其它杂质。否则，样品提取液中残留的糖在加入浓硫酸和咔唑—乙醇溶液后会形成其它呈色化合物，严重影响正常测定。 (4)当果胶含量较高时，应对提取液进行稀释后再进行测定。 5木质素的测定 参照鞠志国的方法 每株果树分别取处理和对照果实100个，9个重复，每个果实从相应部位取组织10克，混匀后进行烘干。按1克样品加入10毫升沸水的比例加水，冷却后加入86%硫酸25毫升，室温下充分搅拌水解4小时，后加入蒸馏水250毫升加热煮沸1小时，冷却后用于预先烘干至恒重的G4砂芯漏斗抽滤，再用热蒸馏水洗涤，洗液用10%BaCl2检查，以不出现硫酸钡沉淀为止，G4砂芯漏斗烘干后称重，以下式计算木质素含量。 木质素%=(抽滤后漏斗重—抽滤前漏斗重)*100/样品重 4果胶酶活性的测定(PG)(比色法) 1.基本原理:果胶在多聚半乳糖醛酸酶(PG)作用下，能水解产生带有还原性醛基的半乳糖醛酸。3,5—二硝基水杨酸试剂可与其发生显色反应。根据颜色的深浅程度，可以通过分光光度计测定PG活性的大小。 2.仪器及用具:研钵、高速冷冻离心机、移液器、离心管、分光光度计、具塞刻度试管、水浴锅、容量瓶。 3.试剂 (1)50mmol/L、pH5.5乙酸—乙酸钠缓冲液 母液A(0.2mol/L乙酸溶液):量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。 母液B(0.2mol/L乙酸钠溶液):称取16.4g无水乙酸钠(或称取27(2g三水合乙酸钠)，用蒸馏水溶解，稀释至1000mL。 取6.8mL母液A和43.2mL母液B混合后，稀释至200mL，即为50mmol/L、pH5.5乙酸—乙酸钠缓冲液。 (2)提取缓冲液(含1.8mol/LNaCl):称取10.5gNaCl，用50mmol/L、pH5.5乙酸—乙酸钠缓冲液溶解，稀释至100mL，摇匀。 (3) 10g/L多聚半乳糖醛酸(果胶)溶液 称取1.0g多聚半乳糖醛酸，溶于100mL50mmol/L、pH5.5乙酸—乙酸钠缓冲液中。 (4)3,5—二硝基水杨酸(DNS)试剂 1)配制500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液。 2)配制262mL的2mol/LNaOH溶液; 3)称取6.3g 3,5—二硝基水杨酸; 4)称取5.0g结晶酚; 5)称取5.0g亚硫酸钠; 6)将2)、3)、4)、5)各成分加入到1)中，搅拌，使之溶解。待冷却后，转人到l000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度，贮于棕色瓶中备用。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。 (5) 1mg/mL葡萄糖标准液 (6)95,乙醇 (7)80,乙醇溶液 4.实验步骤 (1)制作标准曲线配制 (2) 酶液制备 称取10.0g果蔬样品，置于经预冷的研钵中，加入20mL经预冷的95,乙醇，在冰浴条件下研磨匀浆后，全部转入到离心管中，低温放置10min，然后于4?、12000×g离心20min。倾去上清液，向沉淀物中再加入10mL经预冷的80,乙醇，振荡，低温放置10min，然后在相同条件下离心。再倾去上清液，向沉淀物中加入5mL经预冷的提取缓冲液，于4?放置提取20min，再经过离心后收集上清液即为酶提取液，4?保存备用。 (3)酶活性测定 取2支25mL具塞刻度试管，每支试管中都分别加入1.0mL50mmol/L、pH5.5乙酸—乙酸钠缓冲液和0.5mL10g/L多聚半乳糖醛酸溶液。再往其中一支试管中加入0.5mL酶提取液，另一支试管中加入0.5mL经煮沸5min的酶提取液作为对照，混匀后置于37?水浴中保温1h。保温后，迅速加入1.5mL3,5—二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5min。然后迅速冷却至室温，以蒸馏水稀释至25mL刻度处，混匀。在波长540nm处按照与制作标准曲线相同的 方法比色，测定各管中溶液的吸光度值。重复三次. 5.计算结果 根据样品反应管和对照管溶液吸光度值的差值，从标准曲线上查得相应葡萄糖质量。多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性以每小时每克果蔬组织样品(鲜重)在37?催化多聚半乳糖醛酸水解生成半乳糖醛酸的质量表示，即μg/h?g。计算公式: 式中m’—从标准曲线查得的葡萄糖质量，mg; m—样品质量，g; V—样品提取液总体积，mL; Vs—测定时所取样品提取液体积，mL; t—酶促反应时间，h; 1.08——葡萄糖换算成半乳糖醛酸的系数(=194/180)。