【doc】传染性法氏囊炎基因工程疫苗研究进展

【doc】传染性法氏囊炎基因工程疫苗研究进展 传染性法氏囊炎基因工程疫苗研究进展 ?52? 积极开展科研活动共获奖13项,其中省级科 技进步三等奖3项,省厅局级科技进步一等奖 两项,二等奖3项,三等奖5项. 为了保证质检工作的科学性,权威性,全 所建立了一套完整的规章制度,完善了质量 保证体系,坚持科学公正,准确,及时的原则, 确保检验质量,使出具的检验报告书准确无 误,从建所以来无一检测事故发生,为全省兽 药饲料添加剂质量保证做出了应有的贡献. 2青海省饲料兽药监囊所 青海省饲料兽药监察所是经省编委批准 成立的全省饲料,兽药和牧草种子质量监督 检验的法定技术执法单位,隶属青海省畜牧 厅.全所设办公室,业务科两个科,业务科下 设饲料检测室,化药中药室,生测室,牧草种 子检验室,精密仪器室五个实验室.全所现有 人员24人,其中大学本科8人,大专3人,中专7 人,高中5人,初中1人,具有中级职称的7人, 初级职称14人.为省级计量认证合格单位. 全所现有实验室29问,建筑面积约438平 方米.配备有各种检验仪器设备46台(件),能 独立承担饲料产品和各种兽药的分析检验以 及牧草种子质量的检定.检测工作不受行政 中国兽药杂志 产品,兽用药品,牧草种子符合有关为宗 旨,通过抽检(或受送检)生产,经营,使用单 位的饲料产品,兽用药品和牧草种子,按国家 标准,部颁标准,地方标准,企业标准进行监 督检验,质量分析,向社会提供公正可靠的数 据.同时承担全省有关饲料,兽药,牧草种子 检验技术交流和干部培训工作. 具体职责是: 1.对省内各种饲料产品进行技术鉴定 和质量监督,检验.拟订饲料,饲料添加剂的 质量标准. 2.根据《兽药管理条例》负责本辖区的 兽药量监督,检验,技术仲裁工作,并定期抽 检兽药产品,掌握兽药质量情况,调查了解本 辖区的生产,经营,使用情况. 3.负责制定和修订兽药地方标准,参与 部分国家兽药标准,兽药检验新技术,新 的研究工作. 4.按照国家有关法规,对我省各地牧草 繁殖地生产单位和省内流通的各类牧草种子 (包括用于饲料生产,绿肥作物,水土保持植 物及辅设草坪的草籽)进行质量和病虫害检 验. 干预.主要任务是以促进畜牧业发展和饲料 r妈如I弓嵇, 传染性法氏囊炎基因工程疫苗研究进展 茎苤盘堑至周顺伍; 申茸兽药萤察所黥…坤酞学(;9.777 传染性法氏囊炎(IBD)是由病毒弓【起的一种急 性传染病,主要侵害3,6周龄的雏鸡.一方面引起雏 鸡发病和死亡,另一方面可造成严重的免疫抑制,给 养鸡业造成巨大的经济损失.因此,各国对该病的防 制都根重视.随着对IBDV分子生物学特性的研究 不断深入,对其变异机理及毒力决定因素逐渐认识 清楚.因此在传统疫苗研究的同时,许多国家对IBD 收稿日期Il996一l2—23 基因工程疫苗也进行了研究和探索,并取得了一定 的进展,本文对这一方面的内容进行丁综述. 1大肠杆誓衰选 IBDV的基因片段首先在大肠杆菌获得表达. A朋d等(2986)将VP3eDNA插入大脑杆菌表达载 体pUR290,291,292,转化大肠杆菌HB101后可筛 选刊表达融合蛋白的菌株.Westernblot检铡发现 表达产物可与针对32KDa的单克隆抗体(Mab17/ 80)发生反应?但与中和性单抗(Mab17/82)的反应 塑!芏箜鲞2蔓塑 报弱.用亲合层析技术纯化融合蛋白,免疫SPF鸡后 可诱导产生特异性抗体,但无中和活性.随后Azad 等(1987)用大肠杆菌表达了IBDV的大片段,表达 的多聚蛋白可以进行正确的加工产生VP2和VP3, 并证明了IBDV的中和性抗原决定簇位于VP2而不 是VP3.他们还发现,VP2上中和性抗原决定簇是构 象依赖性的.去污剂处理和加热可破坏其构象,失去 与中和抗体结合的能力.Jagadish等(1988)用大肠 杆菌表达了1BDV大片段.证明VP4是加工多聚蛋 白前体的蛋白酶.目前,VP2是研究IBD基因工程疫 苗的主要目的基固. 姜平等(1966)用pCYTEXP1表达质粒在大肠 杆菌表达了南京IBDV野毒株VP2eDNA片段,井 证明表达产物可与IBDV阳性血清结合,但对鸡的 免疫保护性尚待进一步研究. 用大肠杆菌表达系统虽然可以大量生产病毒抗 原,相对来说方法简便易行.成本较低,但大肠杆菌 为原棱表达系统.其表达产物不能象真棱表达系统 那样进行适当的加工和修饰,从而不能形成正确构 象,虽然可刺激机体产生高水平抗体,但这些抗体投 有中和活性,不能抵抗IBDV感染(Azadeta1., 1991),固此,人们把注意力集中到真棱表达系统. 2酵母寰达 酵母已成功地用于表达人乙型肝炎表面抗原, 是最早也是最成功的基固工程疫苗之一.酵母也可 用来表达1BDV基固,表达产物具有良好的免疫原 性. Jagadish等(1990)用不同载体在酵母(Saccha- rotateseerevisiBe和schizosaccharomycespombe) 中表达了IBDV的大片段,结果表明,以非融合蛋白 形式表达的多聚蛋白经过后或翻译过程中的加 工,可产生正确的VP3,但VP2检测不到.但以融合 蛋白形式表达的蛋白前体可产生稳定的VP2和 VP3,说明在表达的多聚蛋白的N末端需要有酵母 部分蛋白序列的保护,否则会技蛋白酶水解.pMF a8PO质粒表达的VP2可以分泌到培养基中,但是 经过高度糖基化,虽然能与中和性单抗结合,但不脆 诱导有效的免疫应答反应. (1990)用酵母(Saccharomyces Macreadie等 cerevisiae)表达了IBDV大片段,表达产物可经过正 确加工.用转化的酵母裂解藏l.0,200(相当于 5OVP2)与弗氏不完全佐剂乳化后注射SPF鸡, 可刺激产生很高的ELISA抗体和中和抗体.用iml ? 53? 免疫鸡的血清腹腔注射1日龄雏鸡.第二天用100 CID的IBDV攻毒,3天后检测雏鸡法氏囊舍毒量. 结果表明,免疫鸡血清可对雏鸡提供很好的保护. Fahey等(1991)用酵母(Saccharomyscegcere— visiae)表达了IBDVVP2.制成油佐剂苗后免疫lO 周龄SPF鸡.免疫剂量为45表达产物.免疫后2周 可检测到抗体,然后持续上升,免疫后6周ELISA抗 体滴度达高峰.中和抗体效价8周后达高峰.用不同 剂量进行免疫,发现5,15和45pg的重组VP2可在免 疫后2周刺激产生ELISA抗体,6周后达高峰{用 I.7重组VP2免疫,4周后才出现ELISA抗体.但 在6周后可达到与其它免疫剂量相同的抗体水平f免 疫后2周绝大多数鸡的中和抗体滴度很低,但4周后 都可检测到,并且不断升高,至少持续到免疫后8周. 用免疫鸡的血清或蛋黄抗体腹腔注射2日龄SPF雏 鸡,一天后用100cI0的IBDV攻毒,可获得100 保护.免疫母鸡产蛋后孵出的雏鸡在3,28日龄攻 毒,全部获得保护{母源抗体的半衰期为5.7天,与传 统疫苗的相近.母鸡在l2周龄时用弱毒苗免疫,2O周 龄时用4O重组VP2肌内注射.可以引起记忆应答 反应.注射后2周,ELISA和中和抗体滴度达到高 峰,至少可以持续到免疫后n周. 上述试验结果表明,用酵母表达的IBDVVP2免 疫,其效果与传统疫苗一样.比起用SPF鸡法氏囊 或细胞培养物制备传统IBD疫苗,酵母菌的培养简 单,方便,所需培养基价格也较低,表达产物经过粗 提即可应用.固此,用酵母表达生产的IBD亚单位苗 完全可以取代传统的油佐剂灭活苗. 3杆扶?毒寰选 杆状病毒(bacalodrus)是无脊椎动物的一类病 毒,绝大多数可从昆虫分离到.近年来对杆状病毒的 研究日益受到人们的重视,这是因为:?杆状病毒 具有高度的宿主特异性,只感染昆虫而不感染人畜 和植物,另外病毒粒子可包在蛋白晶体内,对细胞外 环境具有报强的抵抗力.因此,可以作为一种杀虫剂 在农业上用于生物防治.@杆状病毒表达载体的构 建和不断完善,使其应用范围进一步扩大.目前已有 多种外源基固在杆状病毒获得了表达,不仅可用来 生产多价(联)基固工程疫苗还可用来研究不同蛋 白质之间的相互作用. 用杆状病毒表达IBDV的基固片段已获得成 功.并且表达产物具有良好的免疫原性.Vakharia 等(1993)用杆状病毒表达了IBDV变异株GLS的 ?54? 大片段,表达产物可以正确加工产生VP2和VP3. 通过抗原捕获ELISA(AC—ELISA)证明,表达产 物能与中和性单抗结合,具有正确的构型}表达产物 占细胞裂解物蛋白的12,13.重组病毒感染的d9 细胞裂解液加弗氏不完全佐剂{L化后免疫2周龄 SPF雏鸡.44龄时加强免疫一次.通过中和试验, ELISA和琼脂扩散试验都可检测到特异性抗体,攻 毒保护试验证明.79免疫鸡可获得保护,表现在: 法氏囊无IBDV增殖;法氏囊无病理组织学变化;法 氏囊重比不低于未攻毒鸡平均值的2SD.他们认为没 有获得完全保护的原因是由于免疫剂量不足.通过 增加免疫剂量,不仅可获得对变异株GLS和E/Del 攻毒的完全保护,对标准毒株的攻击也有保护,但注 射一次,保护率仅44,用两十剂量免疫则可获得完 全交叉保护(Vakhaaeta1..1994). Snyder等(1994)将标准株D78的中和性抗原决 定簇B69的编码区(NdeI—NarI片段,0.26Kb)插 入变异株GLS的VP2编码区,形成的嵌合基因克隆 入杆状病毒载体,与杆状病毒重组后,睬表达BS9 外,GLS株VP2和VP3上的抗原决定簇可以正常表 达,不受任何影响.用表达产物免疫SPF自来航鸡, 仅用一十剂量即可获得完全保护,不仅对变异株而 且对标准株的攻毒也可保护.充分显示了其应用前 景. 裴建武等(1996)用杆状病毒作载体在昆虫细胞 表达了IBDVCJ一801bk~株VP2eDNA片段,直接 荧光抗体及dot—ELISA检测表明,表达产物能够 与特异性抗体结台,Western--blot检测发现,表达 产物不能够与特异性抗体结合,这说明表达产物可 能具有构象依赖性.用表达产物免疫SPF雏鸡,可提 供部分保护. 4构囊活t俸疫苗 火鸡疱疹病毒(HVT)是应用很广瑟的预防马立 克氏病的疫苗.近年来.科学工作者发现.HvT可以 作为禽病活载体疫苗的表达载体.直接用于构建多 联或多价疫苗.目前.已有多种外源基因在HvT中 获得表达,如马立克氏病病毒的gB基因(Rosset al_,1993)和新城疫病毒融合蛋自基因(Morganet al,1992,1993).最近Darteil等(1995)将52/70株 IBDV的VP2基因插入HvT.构建了两株表达VP2 的重组病毒:vHVT001和viiVT002.vHVT001中 的VP2基因不带有外源启动子,而vHVT002中的 VF2带有人巨细胞病毒早早期启动子(HCMV一 中国兽药杂志 IE).1日龄SPF雏鸡用不同剂量的重组病毒肌注免 ,vHVT002对 疫,3周龄时进行攻毒试验,结果表明 IBDV的攻击有很高的保护率.10'PFU免疫的雏鸡 可获得100保护,10'PFU免疫组60保护. vHVTO01免疫保护率较低,10PFU免疫可获得 5O保护,10'PFU免疫仅33得到保护.出现这种 差别的原因是,vHVT001中VP2不带有外源启动 子,其转录靠插入基因或其上游基因的启动子.而 vHVT002中VP2带有HCMV--IE,该启动子具有报 强的启动效率. 近年来,国内外学者对鸡痘病毒的分子生物学 进行了探入细致的研究.鉴定出许多复制非必需片 段,为鸡痘病毒载体的研究奠定了基础.Bay[iss等 (1991)将IBDV52/70株编码VP2的基因插入禽瘟 病毒(FPV)构建了重组病毒IpIBD1-以融合蛋白 (与P一半导L糖苷酶融合)形式表达VP2.用重组病毒 在1日龄和14日龄时免疫SPF鸡,在28日龄时用s2/ 7O或CS89强毒攻击,免疫鸡可免于死亡.但法氏囊 仍有损伤攻毒前采血分商血清.用ELISA和中和 试验都检测不到特异性抗体,这可能是由于以融合 蛋白形式表达,或因为带有VP4部分序列使VP2的 构型受到破坏.另一方面说明细胞免疫可能起一定 作用. Heilie和Boyle(1993)将IBDV的VP2cDNA 插入FPVTK基因的下游,用FPV启动子PE/L启 动VP2cDNA的转录,构建了重组病毒FPV—VP2. 同时将IBDV大片段插入FPVTK基因,用痘苗病 毒晚期启动子P.Lll启动转录,构建了FPV-VP2. 4.3.重组病毒感染鸡肛皮肤细胞后可表达IBDV蛋 白,大片段的表达产物可以经过正确的加工.但外源 基因在FPV—VP2的表达量是FPV—VPZ.4.3的5倍. 用FPV~VP2接种SPF鸡.2,3周后可产生低{茼度 的中和抗体,井能抵抗低剂量的1BDV的攻击.而 FPV—VP2.4.3免疫后,厩不能产生抗体,也不能抵抗 IBDV的攻击.这是因为大片段插入TK基因后使 FPV的毒力降低,从而使其增殖能力下降. VP2具有很高的琉水性,不古有信号肽和穿膜 序列;虽然在氨基酸序列中有可糖基化的位点,但不 能被糖基化.为了使表达的VP2到达细胞膜.以增强 其免疫原性.Heine等(1994)将VP2与流感病毒神 经氨酸酶或血凝素的信号肽序列和穿膜序列设法连 接.用FPV表达出杂台分子.结果发现,古有血凝素 C末端穿膜序列的VP2杂合分子表达后刊达细胞表 !!!芏蔓鲞蔓塑 面,并且经过N,糖基化I而与神经氨酸酶N端信号 肽/穿膜序列融合的VP2可造成细胞裂饵,太部分 VP2未经过糖基化.虽然经过免疫检测(免疫荧光, dot--ELISA和免疫沉淀)发现所有表达产物都能与 特异性单抗结合,但VP2杂合分子刊达细胞表面并 没有象预期的那样使免疫原性增强,相反,使其诱导 抗体的能力下降,并失去其免疫保护能力,其原因可 能是:信号肽/穿膜蛋白与VP2融合改变了VP2的构 型I糖基化也可能影响其构型.从而使其免疫原性降 低. 陈忠斌等(1996)以IBDV弱毒疫苗毒株D78基 因组为模板,经RT-PCR扩增出1.5Kb片段,将该片 段克隆后正向插入禽痘病毒启动子下游,连同P11? LacZ摄告基因盒插入FPV转移载体中,构建成FPV—VP2重组转移载体.我们已将CJ?801bk{株IB- DV的VP2基因插入禽痘病毒载体,构建成转移载体 pEFL29.VP2(未发表资料),为我国IBD基因工程活 载体疫苗的研究奠定了基础. 5结语 lBD是目前危害养鸡业的主要传染病之一,免 疫接种是主要的防制措施.虽然传统疫苗在控制该 病的拢行方面发挥了很大作用,但由于变异毒株和 超强毒株的出现,使该病的防制出现困难.现有疫苗 不能保护.这就促使人们研制新型疫苗.基田工程疫 苗是研究方向之一.通过近几年的研究,在IBD基因 工程疫苗方面虽然取得了很大进展,但由于受表达 量渡茁实用性厦毒抹变异等方面的影响,离实用还 有一定距离,如何饵决这些问是今后的研究方向. 参考文献 1陈惠斌.于康震,箭宜为,等.中国畜牧瞢医擘会第十届 全国会员代表大会暨学术年会集(兽医卷).中国 农业大学出版杜.1996,97,1O0 ,一S ?55? 2姜平,陈博言,蔡宝样.中国畜牧兽医学会第十届全国 会员代表太会暨学术年会论文集(兽医卷).中国农韭 大学出版杜.1996.93,97 3裴建武,郭玉瑗,周厢伍,等.中国畜牧兽医学会第十届 全国会员代表大会叠学术年会论文集(兽医卷).中国 农业大学出版杜.1996.35,41 4AzadAA.JagndishMN.Bg-ownMActBI_Virology, 1987,161,?5,152 5AzadAA.MekernNM.Macread/eIGetBI_Vaccine, 1991.9,715,722 6BaylissCD.PetersRW,CookJKAetaLAeh.vitel, 1991.120,193,205 7D~rteilR.8ublotM,LaplaceE,etaLVirology, 1995.211.48l,490 5FaheyKJ,ChapmanAJ,MecrendloIGetBI.Avian Pathczlogy,1991,20,447~460 9HeineHG.andBoyle,DB.Arch.Viral,1993,131, 277,292 10HeineHG,Hyatt,AD,andBOyleDB毗a1.Virus Research,1994,32,313,325 11fagadishMN,et.Gene.1990,95,l79,186 12JagndishMN.StatonVJ,HudsonPJeta1.JVirok gY.1988,62,1054~1087 13M~crcadielG,VagghanPR,ChapmanA7,etB1.V4卜 cine,1990,8,549~558 14MorganRW,GelhIJr'SchreursCS,毗aLAvian Dis,1992,36.858~870 15MorganRW,GelbJlr,popeCR,毗a1.AvianDis, 1993.37,1032,1040 16RossLJN,BirmsMM,J~ersP,eta1.JGenVIrol? 1993,74,371,377 17SayderDB,VakhariaVN.Mengel-whereatSA.et a1.AvlanDis,1994,38.701,707 15VakhariaVN,SayderDB.HeJetaI_JGenViro1. 1993,74.1201,1206 19VakharlaVN.SayderDB,LQtticIlenD.eta1.V拈 clne.1994,12.452~456 貉七移善嘲吝 铬的生物学意义及应用前景固 …饲料川660041…卫蛐麓.四川省兽药饲料监察所四川成都??量庆市兽医卫生检痤站.J 铬(Chromium,Cr)做为动物机体必需的散量 矿物营养元素,最早发现其生物活性的是Schwartz 收稿日期:1996,12—04 和Mertz(]9$9)t之后l工作者对铬在人体作用方面 研究颇多.近年.对动物体影响的研究莲渐多起来. 为了推动铬(3)的开发应用进程.特做简要综述.