【doc】恩诺沙星、氧氟沙星在鲤鱼体内的血药浓度测定

【doc】恩诺沙星、氧氟沙星在鲤鱼体内的血药浓度测定 恩诺沙星、氧氟沙星在鲤鱼体内的血药浓度 测定 第16卷第1期 2OO3年5月 水产学杂志 al皿NESEJ0ImNALOFFISHERIES V01.16.No.1 biay.2OO3 文章编号:1005—3832(2003)01—0005—04 恩诺沙星,氧氟沙星 在鲤鱼体内的血药浓度测定 张雅斌,张祚新,刘艳辉,祖岫杰,熊占山 (1.吉林省水产科学研究所,吉林长春130033;2.解放军军需大学,吉林长春130062) 摘要:应用高效液相色谱(nVLC)法建立广谱抗菌药物恩诺沙星,氧氟沙星在鲤鱼体内 的血药浓度测定方法.采用C18反相柱,流动相为甲醇:0.01mol/L四丁基溴化铵(20: 8o),磷酸调节pH至3.0,紫外检测,流动相流速为1.0ml/min,检测波长278nm,按外 标法计算得出恩诺沙星,氧氟沙星在鲤鱼体内血浆中的药物含量. 关键词:恩诺沙星;氧氟沙星;血药;测定 中图分类号:R917文献标识码:A ,氧氟沙星因其广泛的抗菌性被医学,兽医界 氟喹诺酮类药物诺氟沙星,恩诺沙星 应用于临床治疗细菌性感染H-3】,系统的药效学,药动学研究成果已有文献记载[4-7]. 近年来诺氟沙星应用于淡水养殖鱼类治疗细菌病的成功例子越来越多,有关药效学,药 物学研究已有报道L8I1.恩诺沙星,氧氟沙星也在水产动物疾病防治中进行了尝 试, 但药物代谢动力学研究相对滞后.由于水产用药普遍缺少药物学理论的规范,及时指 导,用药多存在盲目性,水产动物的耐诺氟沙星菌株已经出现,因此,对恩诺沙星,氧 氟沙星的药动学研究显得十分必要.在水产动物的药物代谢动力学研究中,血药浓度测 定方法的建立是首要条件. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1试剂及药品四丁基溴化铵(分析纯)北京市兴福精细化工厂生产;甲醇(色 谱纯)液相色谱专用试剂,乙腈(色谱纯)液相色谱专用试剂,山东省禹王实业总公司 化工厂生产;恩诺沙星标准品(批号H051200),氧氟沙星标准品(批号Hyf0204~),由 中国兽药监察所提供;恩诺沙星原料药(含量99.6%,批号0103210)浙江华义医药化 工有限公司提供;氧氟沙星注射液(含量2mg/~a,批号0104142)四川奇力制药有限公 司提供. 1.1.2仪器高效液相色谱仪,WaterBaseline一810,美国;U—Boxdapek—C183.9× 300ramI.D柱.Sk—l快速混匀器,江苏医疗仪器厂;TGL16E高速台式离心机,上海医 疗仪器厂;SANYO一80~C低温冰箱,日本;M27一l电子天平,梅特勒一托利多仪器 收稿日期:2O02—10—22 ? 6?水产学杂志第16卷 (上海)有限公司. 1.1.3实验鲤鱼恩诺沙星实验用鱼由新立城水库渔场提供,体重96.9?26.9g,实验 水温25?1?;氧氟沙星实验用鱼由吉林省水产科学研究所科研中试基地提供,体重 144.6?27g,实验水温20?2?.暂养于0.4×0.5×0.8m的水族箱内,每箱5尾. 1.2方法 1.2.1色谱条件流动相为甲醇:0.01mol/L四丁基溴化铵(20:8o),磷酸调节pH至 3.0.流速1.0ml/min;灵敏度为AUFS;检测波长为278nm. 1.2.2给药恩诺沙星氧氟沙星给药剂量按10g/kg体重,以混饲口灌的方式,用钝头 大注射器灌人鱼前肠,无回吐者保留实验.实验鱼群体看作一个整体,样本数目为5. 1.2.3血样采集注射器围心腔采血,给药前同批鱼采空白血浆一次,于给药后0.017, 0.75,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,10.0,24.0,72.0h各点分别采血I.0ral,置于含l%肝素 的离心管中,混匀,8000r/min离心15min,分离血浆,一28?保存待测定. 1.2.4血样处理从冰箱中取出血浆,自然解冻后摇匀,准确吸取0.25IIll,置于7ml 具塞塑料离心管中,加5ml乙腈,旋涡快速混匀器上混匀2min,以3600r/rain离心 15min,吸取全部上清液于另一7ml离心管中,于7O?水浴N2吹干,然后再加入3ml乙 腈进行二次提取,处理方法同上.用0.2ml流动相溶解药物,洗净离心管,倒入1.5ml 尖底塑料离心管中,1000r/min离心10min,取上清液2O上HPLC. 1.2.5标准品标准曲线制备准确称取0.05mg干燥恒重的恩诺沙星和氧氟沙星标准 品,置于50ml烧杯中,加入2.5ml1%醋酸溶解后,转移至50IIll棕色容量瓶中,用超纯 水稀释至刻度,8?冰箱内保存备用.取10ml棕色容量瓶11支,将上述母液按0.25, 0.5,1,2,3,4,5,8,16,32mg/L的含量用微量移液器加入到1O个容量瓶中,第一 支不加药,然后用流动相稀释至10ml.取20上HPLC.峰面积为纵坐标,浓度为横坐 标作标准曲线,并求出回归方程和相关系数. 1.2.6血浆标准曲线制备在22支7ml的具塞试管中各加入0.25IIll空白血浆,再分别 依次加入2oo氧氟沙星和2oo~1恩诺沙星标准液系列(O.25—32mg/L),快速混匀器混 匀2min,使上述试管样品浓度分别含氧氟沙星和恩诺沙星为0,0.25,0.5,2,3,4, 5,7,9,16,32mg/L.按"血样处理"方法处理至氮气吹干后,准确加入流动相0.2ml 溶解,快速混匀2min,待药物完全溶解后转移至1.5ml尖底具塞离心管中,10000r/rain 离心10min,取上清液2OIIll上HPLC,峰面积为纵坐标,浓度为横坐标作出血浆标准曲 线,并求出相关系数和回归方程. 1.2.7回收率测定将0.5,1,2,4,8mg/L恩诺沙星和氧氟沙星标准液0.2ml加入空白 血浆0,25IIll,按"血样处理"方法处理至氮气吹干后,准确加入流动相0.2ml溶解,快速 混匀2min,待完全溶解后转移至1.5ml尖底具塞离心管中,100(Dr/min离心10min,取上 清液20ml上HPLC,每个浓度做5次重复.获得各样品的峰面积,再按血浆标准曲线回归 方程计算得恩诺沙星和氧氟沙星的浓度值,并与原来加入量比较计算绝对回收率.同时将 恩诺沙星和氧氟沙星标准液直接用流动相稀释至浓度为0,5,1,2,4,8mg/L,每个浓度 作5次重复.进样20ml作HPLC分析.根据下式计算绝对回收率. 1期张雅斌等:恩诺沙星,氧氟沙星在鲤鱼体内的血药浓度测定'7' 绝对回收率=叁×100% 1.2.8方法精密度取浓度为0.5,l,2,4,8,mg/U恩诺沙星和氧氟沙星标准液 0.2ml,加入空白血浆,按"血浆处理"方法处理至氮气吹干后,准确加入流动相0.2ml 溶解药物,快速混匀2min,倒入1.5ml尖底离心管中,10000r/min离心lmin,取20ml 上HPLC,测得恩诺沙星和氧氟沙星峰面积,每个浓度日内做5次重复,计算日内精密 度,同上法,每个浓度一周内重复5次,计算日间精密度. 2结果与讨论 2.1色谱行为 流动相为甲醇:0.01mol/L四丁基溴化铵(20:80),pH3.0,流速为1.0m[/min,灵 敏度为AUFS,检测波长278nm的色谱条件下,基线走动平稳.血浆样品中在7min以前 有杂峰出现,恩诺沙星和氧氟沙星的保留时间均在8min以后(8.350min,13.508min), 杂峰和药物峰分离良好. 2.2线性关系和灵敏度 血浆中的恩诺沙星和氧氟沙星在0.25,32vg/ml浓度范围内线性关系良好(恩诺沙 星r=0.9996,氧氟沙星r=0.9995). 2.3回收率与精密度 恩诺沙星的绝对回收率94.46?5.37%,相对回收率99.92?5.37%;氧氟沙星的绝 对回收率97.I1?5.79%,相对回收率99.74%?3.46%.恩诺沙星的日内变异系数为 2.76%,日间变异系数3.63%;氧氟沙星的日内变异系数为3.13%,日间变异系数为 4.28%.二药日内变异系数和日间变异系数均小于10%. 2.4恩诺沙星和氧氟沙星的血药浓度 以上述色谱条件测得恩诺沙星和氧氟沙星的血药浓度见表1.可见药物在鲤鱼体内 的分布和消除项明显,药物达峰时间确定,可以进行有关药动学参数分析. 表1混饲口灌给药后恩诺沙星和氧氟沙星在鲤血液中的药物含量(n=55) Table1contentofEFXandOFXinbloodofcarpmetermixedindletoraladministration ? 8?水产学杂志第l6卷 3小结 从鲤鱼心腔采血,以上述色谱条件进行I-IPLC测定,可获得较高灵敏度和精密度, 血药浓度在0.25,32tc/na范围内线性关系良好,血药浓度测定值可进一步分析得出相 关参数.证明该测定方法适用于鱼类体内恩诺沙星和氧氟沙星的药代动力学研究. [10] 参考文献 ScheerM.StudiesOiltheantibacterialactivityaaytal[J].VetMedRev,1987,2:90—99. PrescottJF,YieldingKM./nu/trosuscebilityselectedveterinarybacterialpathogenstociprof loxacin, enroflo~acinandnorn假acirI[J].CanJVetRes,1990,54:195—197. 方炳虎,曾振灵,冯淇辉,等.恩诺沙星对鸡大肠杆菌病及葡萄菌病的药效研究[J].中国兽 医,1997,17(2):157—160. 曾振灵,冯淇辉.恩诺沙星在猪体内的生物利用度及药物动力学研究[J].中国兽医, 1996,16(6):606—612. 施耀国,张菁,郁继诚,等.左氟沙星和氧氟沙星的临床药物动力学[J].中国新药杂志, 1997,6(5):376—378. 刘雅红,冯淇辉,方炳虎,等.氧氟沙星对霉形体大肠杆菌合并感染鸡的药效学研究[J].畜 牧兽医,1998,29(5):431—437. 胡功政,冯淇辉.恩诺沙星及其活性代谢物在鸡体内的药物动力学[J].中国兽医, 1999,19(2):171—174. 严雪芬,王杏明,张黎明.团头鲂,鲫鱼等爆发性疾病的药物防治研究[C].鱼病学研究论文 集.北京:海洋出版社,1995,2:40一,t6. 张雅斌,张柞新,郑伟,等.诺氟沙星在鱼类细菌性疾病中的应用研究[J].大连水产学院学 报,2O00,15(2):79—85. 张雅斌,张柞新,郑伟,等.不同给药方式下鲤对诺氟沙星的药代动力学研究[J].水产学 报,20O0,24(6):559—563. T1ledeterminationofEnrofloxacinandNorlloxacinumincarpblood ZHANGYa—bin1, ZHANGZuo—xin2,LIUYan—hui,ZUYou—jie,XIONGZhan—shah (1JflinProvince,JilinFisheryResearchInstituteClmr~hmt130033,Cllina; 2Departmentveterinarymedicine,Omgchun130062,Q】iI18) Abstract:DetenninatedtheEnroflocacinandNoffloxacinumincarpbloodusingthehign performanceliquidchromatograph(HPLC).anti—phasc~omnisC18,thest_reaming movementphasismethanol:4一Butyl— Ammoniumbromide(20:80),adj~tedPHto3using thephosphoricacid,usingtheultra— violetraydetector,thespeedofthestreamingmovementphas is1.0ml/min,detectedwavelengthis278mn,usingexo—mark— techniquecaculatethecontent oftheEnrofloxacinandNoffioxacinum. Keywords:Enroflocacin;Nodloxacinum;bloodmedicine;determinate 1i1J1J1J1{l=Ib