肝细胞生长因子对高糖及结缔组织生长因子培养的肾小管上皮细胞纤维化的影响

肝细胞生长因子对高糖及结缔组织生长因子培养的肾小管上皮细胞纤维化的影响 肝细胞生长因子对高糖及结缔组织生长因 子培养的肾小管上皮细胞纤维化的影响 ? 636? 南京医科大学(自然科学版) ACTAUNIVERSrrAnSMEDICINAUSNANJING(NaturalScience) 第26卷第8期 20o6年8月 肝细胞生长因子对高糖及结缔组织生长因子培养的肾小管上皮细胞纤 维化的影响 王昆,刘超,袁庆欣,刘翠萍,徐宽风,茅晓东 (南京医科大学第一附属医院内分泌科,江苏南京210029) [摘要】目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)对高糖及结缔组织生长因子(CTGF)诱导肾小管上皮细胞(HKC)纤维化的影响. 方法:体外培养HKC.分别在高糖及CTGF环境下加人不同浓度人重组肝细胞生长因子(rhHGF),以RT-PCR检测转化生长因 子B.(TGF.B.),CTGF,以及纤维化指标?型胶原(COL4A1),纤连蛋白(FN),仅平滑肌肌动蛋白(-SMA)等的基因达.结果:高 糖及CTGF刺激下.细胞因子和纤维化指标表达均不同程度增加,其中,CTGF作用下,COL4AI表达明显低于高糖组(P< 0.01).高糖及CTGF环境下加人rhHGF后,纤维化指标显着降低(P<0.01),其中高糖+rhHGF组,CTGF表达减少,TGF-13I表 达无明显改变(P>0.05).结论:HGF可通过抑制TGF.B下游因子CTGF的表达,发挥抗肾小管上皮细胞纤维化作用,但CTGF 并不是其惟一的阻断途径. [关键词】糖尿病肾病;肝细胞生长因子;结缔组织生长因子;肾小管上皮细胞 [中图分类号】R587.1[文献标识码】A[文章编号】1007-4368(2006)08-0636-05 Effectofhepatocytegrowthfactoronhumanrenaltubularepithelialcellsinducedbyhigh glucoseandconnectivetissuegrowthfactor WANGKun,LIUChao,YuanQing-xin,LIUCui-ping,XUKuan-feng,MAOXiao-dong (DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospitalofNJMU,Nanjing210029,China) [Abstract]Objective:Toinvestigatetheprotectiveeffectofhepatocytegrowthfactor(HGF)onhumanrenaltubularepithelialcells inducedbyhighglucoseandconnectivetissuegrowthfactor(CTGF).Methods:DifferentconcentrationsofrhHGFwereaddedintothe culluremediacontainingglucoseandCTGFrespectively.TheexpressionofTGF-131,CTGF,andcollagenIVAl(COL4AI),fibronectin (FN),0c-smoothmuscwlaractin(or-SMA)mRNAweremeasuredbyRT-PCR.Results:Thecytokinesandfibrosisindexeswereelevated atdifferentlevelsaftertheHKCwereincubatedwithhighglucoseandCTGF,andexpressionofCOIAAlwassignificantlyhigherin highglucosegroupcomparedwithCTGFgroup.ThefibrosisindexesweredecreasedsignificantlyinrhHGF-treatedgroup.Theexpression ofCTGFwasdown-regulatedandthatofTGF-13IremainedunchangedinhighglucoseandrhHGFgroup,Conclusion:HGFcaninhibit thefibrosisofhumanrenaltubularepithelialcellsviasuppressingthesynthesisofCTGF,butotherindependentpathwaystillexists. [Keywords]diabeticnephropathy;hepatocytegrowthfactor;connectivetissuegrowthfactor;renaltubularepithelialcell [ActaUnivMedNanjing,2006,26(8):636-639,648] 随着糖尿病发病率的日益增高.糖尿病肾病 (DN)已成为终末期肾病的最常见原因.肾小球硬化, 足突细胞凋亡以及肾小管问质纤维化为DN三大病 理改变.由于结构及功能的原因.肾小管间质纤维化 在DN的发展过程中起着重要的作用.其对DN肾损 害的提示作用比肾小球及足突细胞更为可靠n]. DN肾小管问质损害过程中.高糖血症一转化 生长因子B(TGF.B)一结缔组织生长因子(CrGF)一 肾小管问质纤维化模式发挥举足轻重的的作用.目 前认为【2],此模式在发病机制上与肾小球硬化有着 同等地位.而抑制TGF.B的下游因子CTGF表达, 可阻断上述途径,延缓肾小管间质纤维化过程.同时 还能够避免因下调TGF.B合成而导致削弱后者抗 炎,抗肿瘤等其他生理功能.肝细胞生长因子(HGF) 为一种促细胞修复因子.在DN肾修复过程中起着 一 定的作用【3】.近年的研究发现【4],HGF能直接抑制 第26卷第8期 2006年8月王昆等:肝细胞生长因子对高糖及结缔组织生长因子培养的肾小管上 皮细胞纤维化的影响?637? CTGF表达,因此,推测HGF可通过阻断上述模式 通路而延缓肾小管间质纤维化. l材料和方法 1.1材料 1.1.1细胞培养试剂 HKC细胞株(南京医科大学第一附属医院肾内 科杨俊伟教授惠赠),DMEM/F12培养基(Gibico公 司,美国),胎牛血清(FCS,Hyclone公司,美国),胰 蛋白酶(Sigma公司,美国),重组人HGF(rhHGF, Peprotech公司.美国)和重组人CTGF(rhCTGF,Pe. protech公司.美国).每1000ml细胞培养液含 DMEM/F1215.6g,谷氨酰胺0.30g,碳酸氢钠1.2 g,青霉素100kU,链霉素100mg. 1.1.2分子生物学试剂 Trizol(罗氏公司,美国),逆转录试剂盒 (Promega公司,美国),PCR试剂盒(Promega公司, 美国),DNAMarker(Fermentas公司,美国),聚合酶 链反应弓}物(上海英骏生物技术公司),引物序列和 扩增片段见表1. 表1引物序列和扩增片段 1.2万法 1.2.1细胞培养及分组 HKC用含10%FCS的DMEM12培养液传代 培养,培养条件为37?,5%CO.0.25%胰蛋白酶消 化细胞后.以lxl06/瓶的密度接种于25ml培养瓶. 用10%FCS—DMEM/F12培养细胞6h后.以无血清 培养基培养12h,使细胞同步于静止期. 弃培养液.将HKC分为5组:?正常对照组: DMEM/F12培养液培养细胞.葡萄糖终浓度5.5 mmoUL:?高糖组:DMEM/F12培养液中加入D.葡 萄糖,葡萄糖终浓度25mmol/L;?rhCTGF组: DMEMl2培养液中加入rhCTGF,rhCTGF终浓度 为5.0ng/ml;?高糖+rhHGF组:在?组的基础上加 人浓度为200ng/ml的rhHGF;?rhCTGF+rhHGF 组:在?组的基础上加人rhHGF,浓度分别为100 ng/ml,200ng/ml.每组设6个复瓶,作用96h后,收 集细胞用于RT—PCR检测. 1.2.2RT-PCR. 按Trizol说明在培养瓶提取细胞RNA,定量 后取总RNA2g作逆转录,步骤参照试剂盒说明 书.取1l逆转录产物为,以50l反应体系 进行PCR扩增.反应参数如下:@TGF"一13和13肌动 蛋白(13一actin)以相同条件扩增:预变性95?5min. 变性94?30s,退火54?30s.延伸72?30s,30 个循环,最后72?延续延伸10min;?COL4A1, 平滑肌肌动蛋白(一SMA)和13.actin:预变性95?5 min,变性94?30s,退火58?30s,延伸72?30s, 30个循环,最后72?延续延伸10min;?CTGF,纤 连蛋白(FN)和13.actin:预变性95?5min,变性 94?30s.退火61.9?30s,延伸72?30s,30个循 环.最后72?延续延伸10min. 取PCR产物5l在2%琼脂糖凝胶上电泳,紫 外灯下观察结果并照相,用计算机图像处理系统处 理.以吸光度代表表达量.计算上述产物的相对表达 量(即各基因条带吸光度/13.actin基因条带吸光度). 至少重复6次独立的RT-PCR全过程. 1.3统计学处理 数据以?s表示,组间比较方差分析及SNK 法.由SPsS10.0统计软件进行统计学处理. 2结果 2.1高糖与rhCTGF对HKC纤维化指标的影响 RT-PCR结果显示.培养96h:?高糖组较正常 对照组COL4A,FN和仅.SMA表达均明显增加;? rhCTGF组较正常对照组COL4A.表达无明显改变 (P>0.05),而FN和仅一SMA表达明显增加(P< 0.01);?cTGF组较高糖组COL4A.表达明显偏低 (P<0.01.见表2和图1). 2.2rhHGF对高糖环境下HKC相关细胞因子及纤 维化指标的影响 椎26卷第8J孵 638-南京科^=学2(K)6fF8 表3rhHGF对高糖环境下ItKCTGF—B和 CTGF基因表选的影响=6.?》 与钳州齄.'f.<"0l 刚'一Pl{}粜艟示.高惭+lI1?l200__rnI 组培养96Iil:f'cF.B表达较高精外【无明收变 l而cI'GI"表达r降叫娃{P<001表3和1):? ('OL4A.F,i和Q—s,lA表达均较高糖纽叫艇F降(P <(I】O】虬表4相I阐1) 23rhHGF对Il(:1?F刺激下HKC纤维化指标的 响 m'-PCI/绡果.rhCTt卜,+rhH《}a培养96 h:jIjl八小剂量rhHCn100_1?1【1,F.^,一SMA 达均较rhCrGF纠叫罹下降《P<0Ol1.,』Jf1人大 剂rhHCI(200llm1).F"一MA丧j较lhCrGF 组下降更为姓菩【尸<0.05】.罔2和罔3 表4rhltGF对高糖环境下HKCCOL4A.和FN基因表达的影响…=^,i?I 计麒较,P(1】』】 MlirkIrl I:I砧叫1:2槲{: I离坪小I11(I1lIH'J ?I_MA ?k 274I'll I35hp IL}II,p 105lip J18lm !l12h|' . n,r?:4.ii'~i特+rhFII IkC粹置带标fll}i,A旧l卿 2 iR I6 14 J2 i l)S l}6 I} I}2 . SM^ ?洲:I纠.}rlI川c卜小州l'1l{.,}?: rl"1(一州特rhIt1.}【 『l1(I(:I一IL转.f'<0.0I:ll?r十小?hIlIIFm :鞋『.<[)05 割2r}It(,F{frh(:F制僦卜?_kllFNIu一M,美 』n《;莉6? I)5hp3讨论 8bl Ilf常刊】;2:rhI,孽i:3:rh【l'GF+小州地rhH} 4rn,}十尢刊埘rMII.【 3rl"IHCI?'埘r.剌激ItKC纤维比指标的影j cT(F作为TGI"'一B的游了.nDN肾小管 上皮细胞纤维化的发J陡过扮演面妥墒乜在 TeFB的诱导下.CT(;r直接什川丁肾小管上皮.导 致者基底脱内FN,胶白(f:nIlagen,等细胞外 基质(ECM)沉积,l垃肾小臂j.J,细胞表型转变 cEMF)因此.抑制cTGF表逃,方面IJ_延缓肾 l二? n川N {t口 第26卷第8期 2006年8月王昆等:肝细胞生长因子对高糖及结缔组织生长因子培养的肾小管上 皮细胞纤维化的影响?639? 小管间质纤维化过程,另一方面可避免因阻断TGF. 生成而导致削弱后者抗炎,抗肿瘤等其他生物学 功能[引. HGF为一对由69Da的ot链和34Da的B链经 二硫键连接的二聚体[9],在人体多种器官广泛表达, 可通过抑制CTGF基因转录,阻断后者的蛋白合成. 在肾脏,HGF主要由肾间质细胞,内皮细胞及巨噬 细胞等合成.晚近的研究发现[1o-.HGF可延缓TGF-13 所致的肾小管上皮细胞纤维化,但其具体途径及机 制仍不明确. 本研究发现,高糖和CTGF可刺激HKC纤维 化因子的表达,但两者有明显差异性:高糖环境下, TGF.Bl,CTGF及COL4Al,FN,ot.SMA表达均明显增 加;而CTGF刺激下,COL4A.几乎不表达.提示 CTGF为高糖环境下HKC纤维化的关键因子,但并 非惟一通路. 本研究还发现.加入rhHGF后,高糖刺激下的 HKCCTGF表达显着下降,而TGF.B.改变不明显, 表明HGF-可抑制肾间质CTGF表达,而对TGF.B的 表达无明显影响.后一结论与Junwei等n]的研究有 悖,但据Inoue等[12]报道,肾损伤后,TGF.B的主要 分泌细胞——肾小管成纤维细胞及巨噬细胞无 HGF受体c—met表达,推断rhHGF可能不直接作用 于TGF.B,此结论仍需进一步证实. 进一步研究发现,加入rhHGF后,高糖刺激下 COL4A1,FN,d.SMA及CTGF刺激下FN,d.SMA表 达均明显下调,提示HGF可通过抑制CTGF表达而 阻断HKC纤维化过程:同时,不同剂量HGF对纤维 化因子表达量的影响,反映了HGF抑制HKC纤维化 过程是剂量依赖性的:而rhHGF可在不影响CTGF 表达的情况下,抑制后者所致纤维化,表明HGF亦 可能通过阻断CTGF的下游途径而发挥作用.但具 体机制仍不明确?.:rhHGF下调非CTGF所致的 COL4A.表达,表明HGF抑制HKC纤维化可能还通 过CTGF以外的其他途径【l引. 高糖血症一TGF.B—CTGF一肾小管间质纤维 化途径作为DN发展的重要模式已得到广泛的关 注,而以CTGF为切入点阻断此途径是目前DN研 究的热点之一.本研究表明,HGF可通过阻断CTGF 表达来抑制DN肾小管间质纤维化的发展,但仍缺 乏特异性.HGF还可能通过CTGF以外的其它途径 或通过阻断CTGF的下游途径发挥其抗肾小管间质 纤维化的作用?引.因此,需要进一步了解HGF阻断 DN发展的具体机制,从而充分认识HGF在DN治 疗中的价值. [参考文献] [1]ChunZ,XianfangM,ZhonghuaZ,eta1.Roleofcon— nectivegrowthfactorinplasminogenactivatorinhibitor一1 andfibronectinexpressioninducedbytransforming growthfactor13linrenaltubularcells[J].ChinMedJ, 2004,117(7):990-996 [2]WenyiC,SusanL,FedpaK,eta1.MechanismsofHepa? tocyteGrowthfactor-inducedretinalendothelialcellmi? grationandgrowth[J].InvestOphthalVisualScien, 2000,41(7):1885-1893 [3]CruzadoJ,UoberasN,TorrasJ,eta1.Regressionofad? vaneeddiabeticnephropathybyhepatocytegrowthfactor genetherapyinrats[J].Diabetes,2004,53(4):1119一 l127 [4]JosepM,CruzadoD,KateS,eta1.Regressionofad— vaneeddiabeticnephropathybyhepatocytegrowthfactor genetherapyinrats[J].Diabetes,2004,53:1119—1127 [5]XianghongZ,JunweiY,YouhuaL,eta1.Bothspland smadparticipateinmediatingTGF?BrinducedHGFre— ceptorexpressioninrenalepithelialcells[J].AmJ PhysiolRenalPhysiol,2005,288(1):16—26 [6]JohnK,CreanG,CroutF,eta1.Theroleof042/44MAPK andproteinkinaseBinconnectivetissuegrowthfactor inducedextracellularmatrixproteinproduction,cellmi— gration,andactineytoskeletalrearrangementinhuman mesangialcells[J].JBiologChem,2002,277(46): 44187—44194 [7]YouhuaL.Epithelialtomesenchymaltransitioninrenal fibrogenesis:pathologicsignificance,molecularmeeha— nismandtherapeuticintervention[J].JAmSocNephrol, 2004,15:1-12 [8]DonaldF,NigelB.Long—termexposureofproximaltubu— larepithelialcellstoglucoseinducestransforminggrowth factor—plsynthesisviaanautocrinePSFDloop[J].AmJ Pathology,2003,163(6):2565—2574 [9]RujunG,AbdallaR,FikouD,eta1.Hepatocytegrowth factormodulatesmatrixhaetalloproteinasesandplasmino— genactivatodplasminproteolytiepathwaysinprogressive renalinterstitialfobrosis[J].JAmSocNephrol,2003, 14:3047—3060 [10]TsutomuI,Hirokazu0.Hepatocytegrowthfactoreoun- teractstransforminggrowthfactor—Bl,throughattenua— tionofcoonectivetissuegrowthfactorinduction,and preventsrenalfibrogenesisin5/6nephrectomizedmice [J].FASEBJ,2003,17(2):268-170 [11]JunweiY,ChunsunD.Hepat~egrowthfactorsup一 (下转第648页) ? 648?南京医科大学 第26第8期 2006年8月 荧光定量PCR技术检测与比较不同基因mRNA或 同一基因不同等位基因mRNA水平时引入此方法 可以使定量PCR结果更可靠,精确. [参考文献] HiguchiR,FocklerC,DollingerG,eta1.KineticPCR analysis:real—timemonitoringofDNAamplificationreac— tions[J].Biotechnology,1993,11(9):1026—1030 YasudaJ.QuantitativePCR:DNAquantificationbvPCR [J].TanpakushitsuKakusanKoso,1996,41(5):499— 5O2 IsonoK.AnovelquantitativePCRwithfluorogenicprobe [J].RinshoByofi,1997,45(3):218—223 BustinSA.AbsolutequantificationofmRNAusingrea1. timereversetranscriptionpolymerasechainreactionas. says[J].JMolEndoerinol,2000,25:169—193 DelendaC,GaillardC.Rea1.timequantitativePCRforthe designoflentiviralvectoranalyticalassays[J].Gene Ther,2005,12(Suppl1):$36—50 EspymJ,UhlJR,SloanLM,eta1.Rea1.timePCRin clinicalmicrobiology:applicationsforroutinelaboratory testing[J].ClinMicrobiolRev,2006,19(1):165—256 BustinSA.QuantificationofmRNAusingreal-timereverse transcriptionPCR(RT—PCR):trendsandproblems[J].J MolEndocrinol,2002,29(1):23—39 BustinSA,BenesV,NolanT.eta1.Quantitativerea1. timeRT-PCR-aperspectii,e[J].JMolEndocrinol,2005, . 34(3):597—601 [9]WongML,MedranoJF.Real?timePCRformRNAquan. titation[J].Biotechniques,2005,39(1):75—85 [10]金冬雁,黎孟枫,译.SambrookJ,FritschEF.ManiatesT. 分子光隆试验指南,2版[M].北京:科学出版社, 1992.46467 [11]LivakKJ,SchmittgenTD.Analysisofrelativegeneex. pressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2 (delta-deltaCt)method[J].Methods,2001,25:402--408 [12]Rodri~ze—LazaroD,HaM,ScorttiM,eta1.Anovelre. al-timePCRforListeriamonocytogenesthatmonitorsana. 1yticalperformanceviaaninternalamplificationcontrol [J].ApplEnvironMicrobiol,2005,71(12):9008—9012 [13]GallinaL,DalPozzoF,McInnesCJ,eta1.Arealtime PCRassayforthedetectionandquantificationoforfvims [J].JVirolMethods,2006,20;[Epubaheadofprint] [14]MattarucchiE,MarsoniM,BinelliG,eta1.Differentre. altimePCRapproachesforthefinequantificationof SNPsallelesinDNApools:assaysdevelopment,char- acterizationandpre-validation[J].JBiochemMolBio1. 2005,38(5):555—562 [15]MehraS,HuWS.Akineticmodelofquantitativerea1. timepolymerasechainreaction[J].BiotechnolBioeng. 2o05,9l(7):848—860 [收稿日期]2006-04—05 (上接第639页) pressesrenalinterstitialmyofibroblastactovationandin. terceptssmadsignaltransduction[J].AmJPathol,2003, 163(2):621—632 [12]InoueT,OkadaH,KobayashiT.eta1.TGF.beta1and HGFcoordinatelyfacilitatecollagenturnoverinsubep? ithelialmesenchyme[J].BiochemBiophysResCommun, 2002,297(2):l55一l60 [13]WenhuaF,MorrisJ,FukadH,eta1.IncreasedMMP.2 expressioninconnectivetissuegrowthfactorover-expres— sionvascularsmoothmusclecells[J].JBiolChem. 2002,227(12):9800—9805 [14]JunweiY,YouhuaL.Blockageoftubularepithelialto myofibroblasttransitionbyhepatocytegrowthfactorpre. ventsrenalinterstitialfibrosis[J].JAmSocNephrol, 2002,13:96—107 [15]RogerM,MasonF,DalaK.eta1.Extracellularmatrix metabolismindiabeticNephropathy[J].JAmSoe Nephrol,2003,l4:1358—1373 [收稿日期]2005—12—01 ]]]]]]]] 一 ,