尼古丁抑制6-羟基多巴胺损伤诱导的CD8＋T淋巴细胞浸润

尼古丁抑制6-羟基多巴胺损伤诱导的CD8＋T淋巴细胞浸润 尼古丁抑制6-羟基多巴胺损伤诱导的CD8 ，T淋巴细胞浸润 脑与神经疾病杂志2007年第15卷第6期 尼古丁抑制6一羟基多巴胺损伤诱导的 CD8+T淋巴细胞浸润 宣琪徐胜利周明陈彪 405 摘要目的:采用6一羟基多巴胺部分损伤大鼠帕金森病模型,探讨尼古丁保护多巴胺能神经元的机制.方法:动 物分别接受尼古丁(O.2mg/kg或2.0mg/kg)或生理盐水腹膜腔内注射.注射7天后,尼古丁高,低剂量治疗组和模型对 照组动物分别接受纹状体内6-OHDA2%tg注射,制作部分损伤帕金森病模型.免疫组织化学及体视学方法定量黑 质多巴胺能神经元和纹状体CD8T淋巴细胞数量.结果:尼古丁低剂量治疗组和高剂量治疗组,6-OHDA注射侧的酪 氨酸羟化酶免疫阳性细胞分别为相应对照侧的64.97?1O.33和67.24?12.67;和模型对照组(25.27?11.79)比 较,差异有统计学意义(P<0.01).此外,尼古丁也可明显减少纹状体CD8T淋巴细胞浸润(P<O.05).结论:尼古丁 可能通过抑制CD8T淋巴细胞浸润,保护多巴胺能神经元. 关键词尼古丁帕金森病6一OHDA,CD8淋巴细胞 0405—04 中图分类号:R742.5文献标识码:A文章编号:1006—351X(2007)06—NicotineinhibittherecruitmentofCD8lymphocytesproducedby6-hydroxydopaminelesio ninthestriatumofSDrat XUANQi,XUSHeng—li.ZHOUMing.eta1. 1,DepartmentofPathology,XuanwuHospitalofCapitalUniversityofMedicalSciences,Bei jing100053,China 2,DepartmentofNeurobiology,InstituteofGeriatriosofBeijing,XuanwuHospitalofCapital UniversityofMedicalSciences,KeyLaboratoryforNeurodegenerativeDiseaseofMinistry ofEducation,Beijing100053,China Abstract:Objective:Toexplorethemechanismthroughwhichnicotineprotectsdopaminergicneuronsagainst6-0H— DAtoxicityinSDratPDmode1.Methods:Ratsreceivednicotineorsalinetreatment(tWOdosestested,0.2mg/kgand2 mg/kg,5injectionsi.P.perdayat2-hintervals).8daysafterthetreatment,asingleinjectionof2Og6-OHDAwas administeredintostriatum.Nicotineorsalinewasadministereddailyunti1animalsweresacrificed.Thedopaminergicneu— ronsandCD8-positivelymphocyteswereanalyzedquantitativelyusingimmunohistochemistryandstereology.Results:The lossofdopaminergicneuronsinducedby6-OHDAinthesubstantianigrawassignificantlylesssevereinthenicotinetreat— mentgroups(atboth0.2and2mg/kggroups)thaninthesalinetreatedgroup(P<0.01).Inaddition,thenumberof CD8一 positivelymphocytesreducedsignificantlyinthenicotinetreatedanimalsascomparedtOsalinecontrol(P<O.05). Conclusion:Ourdatasuggestthatnicotinemayhaveaneuroprotectiveeffectagainst6-OHDAinduceddopaminergiclesion byinhibitingtherecruitmentofCD8一positivelymphocytes. Keywords:NicotineParkinson'sdisease6-OHDACD8一positivelymphocyte 帕金森病(ParkinsonSdisease,PD)的主要病理 特征是中脑黑质多巴胺能神经元进行性死亡,其病因 至今仍不清楚.. 流行病学调查研究结果显示,吸烟与PD发病之 间存在着明显的负相关关系.已有临床研究证明尼古 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30671950,30430280, 30371574);国家科技攻关基金资助项目(2004BA720A03) 作者单位:100053北京首都医科大学宣武医院,病理科(宣 琪),北京老年病研究所神经生物学研究室,教育部神经变性病学重点 实验室(宣琪,徐胜利,周明,陈彪) 通讯作者:徐胜利 丁(Nicotine)或尼古丁激动剂有助于运动症状的改 善,而采用各种PD动物模型的研究也证明尼古丁或 尼古丁激动剂确可有效地减少黑质纹状体损伤,保护 多巴胺能神经元[1].我们利用6-OHDA单侧部分损 伤制作PD大鼠模型,发现尼古丁可以抑制6-OHDA 引起的多巴胺能神经元丢失,并可抑制炎症反应所导 致的淋巴细胞浸润,尤其是细胞毒淋巴细胞(CD8T 淋巴细胞)的浸润. 材料和方法 1.动物处理和6-OHDA单侧黑质部分损伤大鼠 406 模型制备:雌性SD大鼠60只,体重约250克,正常饮 食,光照,饲养于清洁级动物房.动物随机分为尼古丁 低剂量治疗组(n一20),高剂量治疗组(n一20),模型 对照组(n一20).分组后,尼古丁治疗组接受尼古丁 腹膜腔内注射(低剂量组0.2mg/kg,高剂量组2. 0mg/kg),每天注射5次,每次间隔2小时.模型对照 组动物接受等量生理盐水注射.连续注射7天后,所 有动物均接受纹状体内6-OHDA20ptg注射,制作PD 模型.具体方法如下:动物经水合氯醛麻醉(100mg/ kg),用立体定位仪(西安西北光电仪器厂)向右侧纹 状体分两点注射6-OHDA(Sigma),每点10/,g(5ug/ l,溶解于含0.1抗坏血酸的生理盐水).左侧两点 注射等量含0.1抗坏血酸的生理盐水.注射速度 1,1/分钟,注射完留针10分钟.立体定位参数:第一 点:前囟点前1.0mm,正中线外侧3.0mm,软脑膜下 5.0mm,门齿于耳间线下2.4mm;第二点:前囟点后 1.0mm,正中线外侧4.5ram,软脑膜下6.0mm,门齿 于耳间线下2.4mm.手术后动物依然接受尼古丁或 生理盐水腹膜腔内注射至处死.每组动物分别于模型 制作后24小时(n一5),48小时(n一5)和4周后(n=== 10)处死. 2.组织处理:动物经水合氯醛麻醉(100mg/kg) 后,打开胸腔,将灌注针经左心室插入升主动脉,固定. 200ml的生理盐水快速灌注后,用1000ml含4多聚 甲醛的0.1M磷酸缓冲液(phosphatebuffer,PB)缓 慢灌注.迅速取脑,在相同固定液中4IC后固定2小 时,于4?入30蔗糖过夜.快速冷冻,冰冻切片机行 纹状体和黑质全长冠状连续切片,片厚20p.m. 3.免疫组织化学和细胞计数:从头侧到尾侧按 次序每隔5张取两张切片分别做小鼠抗人酪氨酸羟化 酶(tyrosinehydroxylase,TH)抗体(1:5,000,Santa Cruz)或小鼠抗大鼠CD8抗体(1:500,AvntigenixA— merica)的免疫组化染色并计数.切片干燥,4PFA/ PBS固定5分钟,丙酮去脂,5正常马血清封闭,入一 抗于4.C孵育过夜,人生物素标记的马抗小鼠IgG(1: 200,用含lg/LBSA的0.1MPBS稀释,SantaCruz) 室温孵育2h,入ABC复合物(1:200,用0.1MPBS稀 释)室温孵育2h,用DAB/HOz(DAB,0.5g/L,PBS 稀释,Sigma)溶液室温避光显色10分钟.脱水,透 明,封固.用含lg/LBSA的0.1MPBS代替一抗作 为免疫组织化学反应的阴性对照,排除二抗的非特异 性结合. 应用体视学方法分别计数左右侧黑质(包括致密 脑与神经疾病杂志2007年第15卷第6期 带和网状带)TH阳性神经元数目和右侧纹状体CD8 ×光镜下(Olympus,BX51)确 阳性淋巴细胞数目:在4 定计数区域的边界,在40×光镜下采集图像(Olym— pus,DP70),用Image—ProPlus5.0(MediaCybernet— icsInc.)图像分析系统计数. 4.统计学分析:所有数据均以均值?差(S. E.M.)表示.多巴胺能神经细胞定量分析,是比较各 组右侧/左侧(100)TH阳性细胞数的百分比值;而 CD8T细胞的定量分析,则是比较不同组6一OHDA 注射侧纹状体CD8免疫阳性细胞的总数.应用SPSS l1.5统计软件行t—test(双尾)分析,P<0.05认为差 异有统计学意义. 结果 1.尼古丁对黑质多巴胺能神经元的保护: 6一OHDA部分损伤PD模型制作4周后处死动 物,TH免疫组织化学染色显示,模型对照组6一OHDA 导致了注射侧(右侧)明显的黑质多巴胺能神经元损 伤,表现为细胞皱缩,体积减小,细胞数量下降(图1. A),注射侧黑质TH免疫阳性细胞数下降到对照侧 (左侧)的25.27?l1.79(图2.).尼古丁处理组 TH免疫阳性细胞数量明显高于模型对照组(图1.B, c),在尼古丁低剂量组和高剂量组,6一OHDA注射侧 (右侧)/x~照侧(左侧)TH免疫阳性细胞百分比分别 为64.97?10.33和67.24?12.67,与模型对照组 比较,差异有统计学意义(P<0.01);而尼古丁低剂量 治疗组和高剂量治疗组之间比较,差异无统计学意义 (P>0.05)(图2.). 图1尼古丁腹膜腔注射对黑质多巴胺能神经元的保 护作用.A:模型对照组;B:尼古丁高剂量治疗组;C:低剂 量治疗组.标尺一200~m 脑与神经疾病杂志2007年第15卷第6期 90 —80 70 搿'. 丑50 晕40 霎3020 尼古丁对多巴胺能神经元的保护作用 0.2mmg'kg 图2尼古丁腹膜腔注射对黑质多巴胺能神经的 保护作用.**和模型对照组比较,P<0.01. 2.尼古丁对6-OHDA注射后纹状体CD8T淋 巴细胞浸润的影响: 图36-OHDA注射导致的纹状体CD8淋巴细胞浸润. A:模型对照组纹状体,标尺=200Fm;B:选定框内局部区 域放大 尼古 时间 图4尼古丁注射对6-OHDA注射后纹状体CD8淋巴细 胞浸润的影响.*和模型对照组比较P<O.05,**和模型 对照组比较P<O.01.蚌尼古丁高剂量治疗组和尼古丁低 剂量治疗组比较P<O.05,##尼古丁高剂量治疗组和尼古 丁低剂量治疗组比较P<0.01.S:模型对照组,I:尼古丁 低剂量治疗组,H:尼古丁高剂量治疗组. CD8免疫组织化学染色结果发现,6-OHDA注射 后各时间点在注射点周围都有免疫阳性细胞散在分布 (图3.A).CD8免疫阳性产物位于细胞膜,未见胞浆 染色.细胞大小不等,外形不,细胞膜表面有许多 突起和皱褶(图3.B,白色箭头所示),为激活淋巴细胞 的特征表现.CD8细胞计数结果显示,各组纹状体浸 407 润淋巴细胞数在手术后24小时最多,至48小时下降 到大约24小时的6O9/6,到手术后4周,只有极少量的 淋巴细胞浸润.尼古丁处理导致了手术后各时间点纹 状体浸润CD8淋巴细胞明显减少,与模型对照组比 较,差异有统计学意义(P<O.05,P<O.01)(图4). 讨论 本研究结果显示,20Fg6-OHDA纹状体注射导 致注射同侧黑质多巴胺能神经元死亡了74.73;在 6一OHDA注射后24小时和48小时,纹状体有大量的 CD8淋巴细胞浸润.尼古丁处理能明显保护多巴胺 能神经元,抑制CD8淋巴细胞浸润. 6一OHDA注射导致多巴胺能神经元进行性和大 量死亡的机制,目前认为主要包括两方面:自由基和多 巴胺代谢产生的醌类产物的毒性作用.在6-OHDA 注射到纹状体的早期阶段,多巴胺能神经元特异性地 摄取6-OHDA,通过产生自由基和有毒代谢产物而使 神经细胞死亡,但在较晚期阶段,多巴胺能神经元周围 的炎症反应在促进神经细胞死亡中起多大作用,还没 有较系统的相关报道.我们在以前的研究中,发现在 6一OHDA纹状体注射后的12周,还可在注射侧黑质 和纹状体发现激活的小胶质细胞和T淋巴细胞浸 润l_3j.而以往研究中也有人发现在MPTP处理的小 鼠黑质和纹状体有大量的T淋巴细胞浸润,其中主要 是CD8淋巴细胞,也有少量的CD4+淋巴细胞]. 然而,在黑质一纹状体多巴胺能神经元损伤过程中,为 何主要是CD8T淋巴细胞浸润,而它们的细胞毒作 用是否参与了多巴胺能神经元损伤过程,目前尚无相 关报导. 以往的研究认为,尼古丁是通过促进多巴胺释放, 减少毒素的摄取,抑制单胺氧化酶,减少细胞内自由基 产生,促进营养因子的表达等实现其对多巴胺能神经 元的保护作用_5].本次研究提示,尼古丁还有可能 通过抑制黑质一纹状体系统的炎症反应来保护多巴胺 能神经元.有研究发现,尼古丁可通过u7nAChR抑制体外培养的小胶质细胞激活和促炎症细胞因子的产 生],但在中枢神经系统是否也存在类似机制,还有待 深入研究. 本研究结果显示,低剂量和高剂量尼古丁腹膜腔 注射均可对抗6-OHDA的毒性,保护多巴胺能神经 元.同时,尼古丁又可明显抑制纹状体CD8淋巴细 胞浸润.而这种抑制作用是否是尼古丁保护多巴胺能 神经元的机制之一,还有待进一步研究证实. (下转第414页) 椰舢姗如妻i砌舢脚如. 翟署血蓑【lu 414 我们利用全硫代修饰的反义寡核苷酸研究其对细 胞的功能影响.因为全硫代修饰后可以提高asODN 对血清及胞内的核酸酶的降解的抗性,延长其作用. 本研究观察到,uPAR的反义硫代寡核苷酸经阳离子 脂质体导人细胞后,经RT—PCR及原位杂交方法观察 到其基因表达明显减弱,翻译的蛋白质产物,即细胞表 面的uPAR也显着下降.利用Boyden小室模型观察 到转染asODN后肿瘤细胞的体外侵袭能力较rODN 及对照组明显下降,而rODN处理的细胞,其侵袭能 力与对照组相比变化不明显,可排除了因寡核苷酸的 非特异性抑制作用而导致细胞的侵袭能力下降.因此 可以认为,反义uPAR寡核苷酸能有效地抑制uPAR 基因和蛋白的表达,并能有效地抑制胶质瘤细胞的体 外侵袭能力.其作用机理可能为反义寡核苷酸进入细 胞后通过碱基互补的原则与靶mRNA结合,形成 DNA:RNA杂交体,从而启动细胞内RNA酶,迅速将 tuRNA降解,使mRNA翻译功能减弱或消失,不能内 产生有效的作用蛋白,从而阻断了肿瘤细胞侵袭的关 键环节. 通常认为肿瘤细胞的浸润是涉及多个步骤的复杂 过程.细胞外的基质蛋白水解被认为是肿瘤细胞浸润 和血管生成的第一个步骤.uPAR不仅与此有关,而 且根据最近的研究,它还与肿瘤细胞的黏附及细胞内 外的跨膜细胞信号传导,甚至和细胞凋亡有关". 因此有人认为uPAR的表达可能是癌细胞侵袭力的 决定因素,是恶性肿瘤浸润转移过程中蛋白溶解活动 启动定位和发展的中心环节[5].抗uPAR的单克隆 抗体及uPA/uPAR结合抑制剂也被证实对肿瘤细胞 的体外侵袭能力有显着的抑制作用[6].针对抑制 uPAR表达的靶向基因治疗,有可能是抑制胶质瘤侵 袭力的有效方法. 脑与神经疾病杂志2007年第15卷第6期 目前基因封闭技术是基因治疗研究的重点和热 点.其中的反义寡核苷酸技术是一种前景广阔的研究 手段.本研究初步研究了uPAR作为反义基因治疗的 靶基因的可行性,建立了胶质瘤细胞体外侵袭模型等, 为我们下一步采用RNA干扰等技术持久高效地抑制 uPAR基因表达以抑制肿瘤细胞的侵袭能力的研究打 下良好的基础. 参考文献 1SideniusN,BlasiF.Theurokinaseplasminogenactivatorsystemin cancer:recentadvancesandimplicationforprognosisandtherapy. CancerMetastasisRev.2003,22(2):205,222 2BhattacharyaA,LakkaSS.MohanamS.eta1.Regulationoftheuro— kinase-typeplasminogenactivatorreceptorgeneindifferentgrades ofhumangliomacelllines.ClinCanRes,2001,7(2):267,76 3张诚,杨恬.uPA/uPAR研究进展国外医学?生理,病理科学与临 床分册,2004,2004,24(8):352,354 4AlfanoD.FrancoP.VoccaI.eta1.Theurokinaseplasminogenac— tivatoranditsreceptor:roleincellgrowthandapoptosis.Thrombo &Haemosta,2005,93(2):2O5,211 5NielsBehrendt.Theurokinasereceptor(uPAR)andtheuPAR—as— sociatedprotein(uPARAP/Endo180):membraneproteinsengaged inmatrixturnoverduringtissueremodeling.BiolChem.2004,385 (1):103,136 6SteinmetzerT.Syntheticurokinaseinhibitorsaspotentialantitu— mordrugs.Drugs,2003,6(2):138,146 7PlougM,GardsvollH.JorgensenTJ,eta1.Structuralanalysisofthe interactionbetweenurokinasetypeplasminogenactivatoranditsre— ceptor:apotentialtargetforanti—invasivecancertherapy.Biochem SocTrans,2002,30(2):177,183 8BuX.KhankaldyyanV.Gonzales—GomezI,eta1.Species—specificu— rokinasereceptorligandsreducegliomagrowthandincreasesurvival primarilybyanantiangi0genesismechanism.LabInvest,2004,84 (6):667,78 (2007—1—8收稿) (上接第407页) 参考文献 1CostaG,Abin-CarriquiryJA,DajasF.Nicotinepreventsstriatal dopaminelossproducedby6-hydroxydopaminelesioninthesub— stantianigra.BrainRes,2001,888(2):336,342 2MeshulCK,KamelD,MooreC,eta1.Nicotinealtersstriatalglu— tamatefunctionanddecreasestheapomorphine-inducedcontralateral rotationsin6-OHDA—lesionedrats.ExpNeurol,2002,175(1):257 , 74 3徐胜利,周明,刘平等.6一羟多巴诱导大鼠黑质的持续胶质细胞反 应.神经解剖学杂志,2005,21(2):133,138 4Kurkowska—JastrzebskaI,WronskaA,KohutnickaM,eta1.MHC classIIpositivemicrogliaandlymphocyticinfiltrationarepresentin thesubstantianigraandstriatuminmousemodelofParkinson'sdis— ease.ActaNeurobiolExp,1999,59(1):1,8 5RoceriM.MoheniR.FumagalliF.eta1.Stimulatoryroleofdopa— mineonfibroblastgrowthfactor一2expressioninratstriatum.J Neurochem,2001,76:990,997 6QuikM.Smoking,nicotineandParkinsonsdisease.TrendsNeu— rosei,2004,27:561,568 7ShytleRD,MoriT,TownsendK,eta1.Cholinergicmodulationof microglialactivationbya7nicotinicreceptors.JNeurochem,2004, 89:337,343 (2007—4—9收稿)