当归浓缩丸提取物对α 葡萄糖苷酶活性的抑制作用.doc

当归浓缩丸提取物对α 葡萄糖苷酶活性的抑制作用.doc 当归浓缩丸提取物对α 葡萄糖苷酶活性的抑制作用 【摘要】目的:从当归浓缩丸中提取α 葡萄糖苷酶抑制剂.方法:利用冷浸得到当归浓缩丸水提物;取部分水提物经醇沉后，浓缩上清液得到其流浸膏;从其水提醇沉中得到粗当归多糖.体外实验观察了当归浓缩丸三种提取物对α 葡萄糖苷酶活力的影响，有效成分鉴定以及当归浓缩丸流浸膏的动力学类型.结果:当归浓缩丸流浸膏对α 葡萄糖苷酶有抑制作用，呈量效关系，氨、α 萘酚反应阳性;其流浸膏对该酶抑制类型为竞争性抑制.结论:当归浓缩丸流浸膏对该酶活力抑制作用可能与含黄酮苷类化合物有关. 【关键词】当归浓缩丸α 葡糖苷酶类酶抑制剂 0引言 在葡萄糖耐量缺损、2型糖尿病早期的治疗中，α 葡萄糖苷酶抑制剂作为我国糖尿病防治指南推荐的一线药物，其作用机制是延缓单糖吸收，降低餐后高血糖.对防止糖毒作用十分重要.近期据文献报道，当归多糖对四氧嘧啶糖尿病小鼠有降血糖作用,1,，其降糖机制是否与抑制α 葡萄糖苷酶活性，延缓单糖吸收有关呢,我们利用具有单一当归成分的当归浓缩丸，对此展开进一步研究. 1材料和方法 1.1材料α 葡萄糖苷酶，购于Sigma公司;对硝基苯酚 α 吡喃葡萄糖苷(pNPG)，购于德国Merck公司;还原型谷胱甘肽，KHK进口分装;拜唐苹，拜耳医药保健有限公司(成分:阿卡波糖，每片含50mg);当归浓缩丸，河南省宛西制药股份有限公司(每粒相当于当归生药0.25g).UV7500可见光分光光度计，上海天美科学仪器有限公司;3650 紫外分析仪，上海科艺光学仪皿厂;SH2 D(?)循环水式真空泵，巩义市英山路予华仪器厂. 1.2方法取当归浓缩丸加双蒸水至相当生药浓度为500g/L，冷浸，研磨，3500r/min，10min离心，得到上清液，备用.取上述水提液加入乙醇至乙醇浓度达50%，混匀，4?冰箱静置过夜后经3500r/min，10min离心，将得到的上清液部分置于坩埚内，在75?水浴中挥尽乙醇，浓缩成流浸膏备用;并把离到的沉淀部分用950mL/L乙醇、无水乙醇各洗2遍，丙酮、乙醚各洗1次得到粗多糖.将提取液滴至瓷反应板上，加数滴三氯化铁试剂，观察颜色反应.将提取物滴至滤纸上，经浓氨水上熏数分钟，立即放到紫外灯下观察是否有黄色荧光反应.取提取物1mL加入数滴双缩脲试剂，混匀观察颜色反应.取提取液1mL加入1~2滴α 萘酚试剂，再延管壁加入数滴浓硫酸，观 察颜色反应.取少量提取液加入数滴碘液试剂观察颜色反应,2-3,. 1.2.1α 葡萄糖苷酶活性测定,4,反应系统为67mmol/L磷酸钾缓冲液(37?，pH6.8)2.0mL，3mmol/L谷胱甘肽溶液50μL，64.0μkat/Lα 葡萄糖苷酶溶液50μL，混匀，37?水浴保温10min后，加入20mmol/LpNPG溶液30μL，再置原水浴中继续保温10min后，经80?水浴中灭活，再加入0.01mol/LNa2CO3溶液10mL冷却后，于波长400nm处测定在酶的作用下释放出对硝基酚(pNP)A值.其中酶活力单位定义:37?，pH6.8条件下，反应体系中pNP在400nm处每分钟A值变化0.001规定为16.67nkat.空白对照管内不加α 葡萄糖苷酶和pNPG，加入等量的蒸馏水补足体积. 1.2.2中药抑制活性的测定反应系统为67mmol/L磷酸钾缓冲液(37?，pH6.8)2.0mL，3mmol/L谷胱甘肽溶液50μL，64.0μkat/Lα 葡萄糖苷酶溶液50μL，中药提取物200μL(阳性药对照管，拜唐苹5g/L)混匀，其他操作同上.中药提取物空白对照管内除不加α 葡萄糖苷酶和pNPG外，加入不同浓度的中药提取物200μL，用等量的蒸馏水补足体积.一个抑制剂活力单位定义:37?，pH6.8条件下，相同时间内降低16.67nkat的A值.抑制百分率,(抑制剂活力/酶活力)×100%,,酶活力-酶活力(加入药物),/酶活力×100%，计算公式简化为:抑制百分率,,1-(中药提取物A值-中药提取物空白管A值)/酶活A值,×100%.另在抑制剂量一定的条件下，加入不同浓度(0.1，0.2，0.4，0.59，0.8，1，1.2mmol/L)的底物溶液，测定酶活力.可得出一系列不同底物浓度条件下的酶活力，用双倒数作图法确定抑制类型. 2结果 2.1当归抑制率5g/L拜唐苹的抑制率为67.5,.31.25，62.5，125，250g/L当归浓缩丸水提物对α 葡萄糖苷酶的抑制率分别为0，1.4,，15.9,，21.1,，表明高浓度当归浓缩丸水提物对α 葡萄糖苷酶的抑制率很低.15.625，31.25，62.5，125g/L当归浓缩丸多糖对α 葡萄糖苷酶的抑制率分别为4.3,，4.3,，9,和19,，表明高浓度当归浓缩丸多糖对α 葡萄糖苷酶的抑制率亦很低.12.5，25，50，100，200g/L当归浓缩丸流浸膏对α 葡萄糖苷酶的抑制率分别为24.1%，23.7%，31.4%，35.2%和62.9%，有浓度梯度的量效抑制关系，在200g/L时抑制率比较明显. 2.2当归浓缩丸流浸膏对α 葡萄糖苷酶的抑制类型当归浓缩丸流浸膏200g/L，加入不同浓度的pNPG(S),测定酶反应速度(V即A)，以1/V为纵坐标，1/S为横坐标作图1显示，Km增大，Vmax不变， 说明当归浓缩丸流浸膏对α 葡萄糖苷酶的作用抑制类型属于竞争性抑制. 2.3当归浓缩丸流浸膏成分鉴定取其流浸膏分别经氨水反应(+)、三氯化铁反应(-)、双缩脲反应(-)、α 萘酚反应(+)、碘反应(-)，结果表明，其流浸膏中可能含有黄酮苷类物质,5,. 3讨论 实验结果表明，当归浓缩丸流浸膏对α 葡萄糖苷酶抑制作用，呈量效关系，对α 葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争性抑制;氨、α 萘酚反应阳性，表明当归浓缩丸流浸膏对该酶活力抑制作用可能与含黄酮苷类化合物有关.然而，其多糖对α 葡萄糖苷酶的抑制作用不明显，说明其降糖作用另有其他机制. 【