【doc】大鼠视神经损伤及修复过程中视网膜睫状神经营养因子mRNA的表达

【doc】大鼠视神经损伤及修复过程中视网膜睫状神经营养因子mRNA的表达 大鼠视神经损伤及修复过程中视网膜睫状 神经营养因子mRNA的表达 中华眼底病杂志2004年11月第20卷第6— ChinJOculFundusDis,— November2004,Vol20,No.6 大鼠视神经损伤及修复过程中视网膜 睫状神经营养因子mRNA的表达 李秀云朱益华唐宝丰徐国兴林经安童绎 355 ? 实验研究? 【摘要】目的探讨大鼠视神经损伤及修复过程中睫状神经营养因子(CNTF)mRNA在视网膜上的 表达及意义.方法35只健康雄性SD大鼠,随机取5只作为正常对照组;另两组为视神经单纯切断组 和视神经一坐骨神经吻合组,每组各15只大鼠.建立大鼠视神经单纯切断和神经一坐骨神经吻合模型,分别 于建立模型后3,7,14d取视网膜组织.应用半定量逆转录一聚合酶链反应方法观察正常大鼠及各模型大鼠 视网膜上CNTFmRNA的表达情况.结果在正常大鼠视网膜上,CNTFmRNA有微量表达,视神经单 纯切断后其表达增加(3,7,14dCNTFmRNA的表达分别增加1OO,594和485),视神经切断并吻合 一 段坐骨神经后,表达增加更明显(3,7,14dCNTFmRNA的表达分别增加258,752和515).结 论视神经损伤后,可通过提高内源性CNTF来应答视网膜神经节细胞(RGC)轴索 反应,保护RGC,为外 源性CNTF的应用提供理论依据. 【关键词】视神经损伤/代谢;基因表达;神经营养因子 中图分类号:R44639R770.43R774.6 mRNAexpressionofciliaryneurotrophicfactorduringinjuryandrepairofopticnervesinrats LIXiu-yun,ZHUYihuaTANGBao}eng,ela1.Department()}Ophthalmology,FirstAffiliated Hospital,FujianMedicalUniversity,Fujian350004,China CDrrPsDgauthor:ZHUYihua,Email:zhuyihua889@hotmail.corn [Abstract]ObjectiveToinvestigatethemRNAexpressionofciliaryneurotrophicfactoronthe retinaduringiniuryandrepairofopticnervesinrats.MethodsThirty— fivehealthySDratswere randomlydividedinto3groups:5inthecontrolgroup.15inthesimplytransectedopticnervegroupand 15intheopticnerve—sciaticnerveanastomosisgroup.Thesimplytransectedandopticnerve—sciaticnerve anastomosedmodelsweresetup,andtheretina1tissuesofal1oftheratsweretakenoutafter3,7and14 days,respectively:andthemRNAexpressionofCNTFinthe3groupswereobservedbysemi quantitativereversa1transcription— polymerasechainreactionmethod.ResultsAminimumexpressionof CNTFmRNAwasfoundintheretinaeofthecontro1group.andtheincreasedratesofexpressionwere foundintheretinaeofthesimpletransectionofopticnervegroupwiththeincreaserateof1OO,594, and485onthe3rd,7th,and14thdayrespectivelyaftertheoperation.whileinopticnerve— sciaticnerve anastomosisgroup,theincreaserateswerefoundtobe258,752and515onthe3rd,7th,and14th dayrespectivelyaftertheoperation.ConclusionRetina1neuronscanrespondtoaxona1react ionof retinalganglioncellsbyup—regulateendogenousCNTFaftertheinjuryoftheopticnerves,whichmay provideatheoreticbasefortheapplicationoftheexogenousCNTF. [Keywords]Opticnerveinjuries/metabolism;Geneexpression;Ciliaryneurotrophicfactor 睫状神经营养因子(CNTF)最初是从小鸡眼的抽 提物中分离出来的一种能促进鸡胚睫状神经节细胞存 活的蛋白质,并因此而得名j.以后的研究发现, CNTF对多种神经元均具有保护作用].有研究报道, 应用外源性CNTF可延缓由于光损伤,轴切及缺血引 起的视网膜神经节细胞(RGC)的死亡,有望用来治 基金项目:福建省科技厅重大科研项目(2000F005) 作者单位:350004福州,福建医科大学附属第一医院眼科[李秀云(现在 潍坊医学院附属医院眼科),朱益华,唐宝丰,徐国兴,童绎],中心实 验室(林经安) 通讯作者:朱益华,Emai|:zhuyihua889@hotmail.eom 疗视神经损伤和神经系统的退行性变.我们观察并定 量了CNTFmRNA在视神经损伤及修复过程中的表 达情况,以期为视神经修复过程中外源性营养因子的 应用提供理论依据. l材料和方法 1.1实验动物和材料 由上海西普尔一必凯实验动物有限公司提供的SD 雄性大鼠35只,体重160~200g.眼部检查:手术显微 镜下角膜透明,前房及晶状体清亮,盖玻片轻压角膜后 36 观察限底见视散色淡红,边界浦.视网膜血管清晰l】_ 见,无出血及渗随饥取5l大鼠作正常刊照:另3O 只大鼠分为}见经单纯田断绁翮{=51神经坐骨神经吻 合组.每纽释I只.右叭怍为实验HIJ:R,A抽提试剂 盎购]=美国Intrio~~-IL公l.Pt【,MIxMarker8购于 美国MHI公司,内别州P,肌动蚩F1f9Actin的上游 引物为5LcCftflgf+g+."Igcgtgtgg:'..下游引物为 5'一gganeeg~[caIIltg3',扩增i物片段为-:】了}】I]. CNTF的上游引物为jatggcttleg[~gglgC;LHfIC+10', 游引物为3Catergc【[FL[L'Ittggcce(j'.扩增:物片段 为5鲫DI].均由f.海生1二生物_1_程技术服务有_5f{公 合成 1.2模建及啦材 _舰神经坐骨神经啊合模型鲋建:氯胺刚按 1ong的剂量腹腔麻醉大鼠.沿右眼眶I:蠓作一I乏 约15cm的皮肤切n.钝性分离出1织致眼球周恫 组织.直到暴露剌J经.分离神经组织.视瓶 后约0n1处剪断{i1J经.将墩门凡鼠自身,一下战k 约l5C0"I的骨伸经近中端与视押经渐端吻台(H10 尼坨线).吻合灶套一艮约5nm的凡体硅控管(单一 】2mm).坐骨l神经游离端用s-)线缝台于头皮单 纯切断组仅在视盘5mn处剪断祝种经后,远j断 端缝台于头皮ii常纽不做任?处理分别于模型 建立后3,,1.iI收人鼠的视网膜绀织.冻荐f8,( 冰箱备用: L3组织总RNA提取及鉴定 取规阿膜怀本.采用TRIzoI一步缓(按-兑I州)提 取组织总RNA每缉各取2fjl样.用紫外线分光光 度计删定总RNA住渡长为26llnnLf280nm时的吸 光度.1R称光密鹱(OD)]值,兄取!J-Jl"琼脂糖 电泳观察RNA有尤明胜降解.其余一?LF保存备 用 1.4半定量逆转求聚台酶键反l直 采用,步法定避逆转录雅台酶涟反窟(RT PCR)试剂行RTpc,R.反应体系含::倍反l混合箍 25txt.游引物lI.!FJ-'ao]I,下游I物:『.21. R丁P_alinumYaq胁l1.组织RNAtbeg.加高 灭菌蒸馏水至总反墟体系为5【】】压应条件为:55,( 逆转采30.9.1L颀变性2mili.R扩增:c 1一58c下jjs.7:2(FIrnin.共{个循珂:.最后 72(延伸rainPCR产物丁_L下保存 1.5}】CR:物椅测 取各纽的PCR产物6丁1.,琼脂精凝胶电 泳-凝胶成像系统进行妖度描.录CNTF硬相应 口A1in的.1俩 I.6统计学 计算c'NTF和13-Actin的.1值比f『f.1l{? 永.r术后不同H寸期棍{申竖竹纯断组千?褪神经 神经啊台与正特对tff,缢之间.同?lI寸问段冲经单纯 目J断绀翱靓神经坐骨神经呦弁组之J均采用 SPSSL-.0统汁软件的Manf】Wl1iI_lYT方法行统 汁学分析,il1.r?5为差异自并H:的卷望 2结果 2.1玺RNA提取嫂AcI…O!J表达 J琼脂筛凝胶电泳鉴定RNA止州降衅总 RNA波长为2一I1l"lI『:sll_l【LIlid.jfft的比值 1.8,2._1税1嘲膜组织总RNA逆转录l?j增出自日 A{in片段约为j:11-IblJ(罔1) 22L,I'FmRNA舡桃网!l~-flll1I内表达 组鼻{总RNA经逆转录.扩增僻到约玳-iihi>的片 段(隔:)尢正常视网睃织;.L')FmRNA丧迭 接微.的丛闪j内对照的.1frL晌比fff1工J._4- ?.抻经嘲断,表达增JJ".损伤聒3,7稍11?d 比值舒别o.66二_o23.2.二_ii.j和I,l0二【i,11. 舒l10t正常对照组增.t1111(/Oll1.t8:.择时1'li5 段与J常刘照组之间比较.篮异均仃牲喾:代的苣义 f—1.1叭,—o.nj1靓神经?断_}?_嘞,{一段坐骨 冲经后-陂的比分纠1为】.18__.!}+!._=t.一l 和!.:)0上J.一舒别比IF常埘!{l=i虮秸【2j,jj21 羽『L一各I:t~tl可段与常对舅}f玑之fn儿L较,差肆均行 显着的意义(z一一1.9,34一.l),视奉if经坐骨 . ,一 ^m?,辫一臻黼 幢饼一??. n;州?_1.nnl三一,?_三M州m…?,台惟.ml_?