丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)的分子病毒学

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)的分子病毒学 摘要：世界范围的高感染率,治疗手段和疫苗的缺乏使HCV成为研究的热点。高效体外复制系统的缺乏，高突变率带来的株系间的不一致，为HCV的研究带来了困难。这个病毒的分离鉴定直接依赖于分子生物学手段。同样是使用分子生物学的手段，研究者对这个病毒的结构和各组分的功能进行了研究。本文从分子角度对这个病毒各组分的结构、功能和相互关系进行了综述，并讨论了HCV诱导疾病、免疫逃避的分子机理。 导言     HCV是一个由脂膜包裹的正链RNA病毒。来源于宿主细胞膜的病毒包膜上整合有病毒编码的包膜蛋白E1和E2。被这层膜包裹的是结合有HCV核心蛋白的RNA基因组。这个看似简单的病毒如今已是人类健康的大敌。     HCV是慢性肝炎的主要致病因子。在美国慢性肝病患者中，40～60％感染了HCV。(Williams，1999)。全世界约有一亿七千万人感染了HCV，这个数字高于感染了HIV的人口(Cohen，1999)。流行病学研究明：约20%慢性肝炎患者要发展为肝纤维化和肝硬化，在这些肝硬化病人当中，20％要发展为肝癌(Seeff，1999)。对丙型肝炎病人的治疗目前还很不成功，在一家美国医院中，研究HCV病人用药结果显示：使用干扰素能清除部分病人体内的HCV，但产生效果的病人不到20％；组合使用干扰素和ribavirin效果稍好一点，但也只对少于40％的病人有效。所调查的样本为感染了不同基因型HCV病人的集合。如果注意到这些治疗方法对于最广泛分布的HCV基因型1效果很差，并且这些药物的昂贵和毒性也不容忽视（McHutchison et al，1998）， 我们不免感受到来自HCV的有力挑战。为了防止HCV的传播，人们在疫苗的研究上投入了很大精力。缺乏有效的体内、外HCV扩增系统，缺乏可信的保护性抗体分析系统以及HCV自身的高突变特性使得疫苗的开发困难重重。尽管目前市场上还没有一个HCV疫苗，蛋白免疫（Choo，et al.，1994），DNA免疫（Fournillier, et al, 1999; Gordon, et al., 2000），重组活疫苗免疫（Makimura, et al., 1996）以及这些疫苗的组合使用（Pancholi et al, 2000; Song et al, 2000）在实验动物中引起了一些鼓舞人心的体液免疫反应和细胞免疫反应。     同样由于没有有效的HCV繁殖系统，从分子水平研究HCV很不容易。目前我们对HCV的认识绝大部分建立在重组技术的基础之上。 基因组：一个ORF和两个UTR     组织培养，显微镜观察和繁复的血清学分析都没有能发现HCV。这个机警的病毒是被分子生物学手段所发现的 (Choo, et al., 1989)。研究者从大体积的高HCV滴度的猩猩血浆中抽提出核酸，制备cDNA并插入噬菌体基因组中。利用HCV病人血清对几百万个噬菌体克隆进行了筛选，只有一个阳性克隆被检测到。一年之后，这个非甲非乙肝炎病毒基因组的顺序被测定。此病毒则被命名为丙型肝炎病毒。由于相类似的基因组组织形式，HCV和黄病毒以及瘟病毒被归类至同一个病毒科－黄病毒科。正链单链的HCV RNA基因组长约9500nt。其5‘和3‘端都含有非翻译区（UTR），UTR之间是一个大的多蛋白开放阅读框架（ORF）。该ORF编码了一个长约3000氨基酸的多蛋白。研究表明这个多蛋白的切割加工由宿主编码的信号肽酶（结构蛋白）以及HCV编码的蛋白酶（非结构蛋白）共同完成。图1为HCV基因组结构示意图，宿主信号肽酶和病毒蛋白酶的对多蛋白的切割位点标注在示意图上。 图1.丙型肝炎病毒(HCV)基因组结构示意图 箭头所示为蛋白酶切割位点； 为宿主信号肽酶切割位点； 为NS3丝氨酸蛋白酶切割位点； 为NS2-3金属蛋白酶切割位点。     在HCV基因组的复制过程中，依赖RNA的RNA聚合酶随机地引入很多错误，结果HCV以非常异质（heterogenerous）的形态而出现，所有HCV株系间的同源性约为70％。HCV基因组的不同区段保守性不同，编码重要功能（聚合酶，核心蛋白，内部核糖体进入位点IRES，等）的区域高度保守，其他区域则含有较多的突变，尤其是膜蛋白的几个高变区。对于HCV的分型，目前被广泛接受的是分为6种基因型，它们之间的核酸差异可达30％。在基因型内部又分为很多的亚型。世界范围内最广泛流行的HCV是基因型1，尤其是1b，该亚型是亚洲，欧洲，北美和澳大利亚主要流行的基因型(Davis，1999)。从同一个病人的血液中分离到的HCV基因组也有很多差异，它们被称为不同的准种。 5'UTR：内部核糖体进入位点(IRES)     5'UTR包含HCV基因组5'端的341个核苷酸。它是HCV基因组中最保守的部分。以单链和双链RNA特异的RNA酶做的酶学分析和计算机比较分析表明5'UTR含有典型的IRES二级结构(Brown, et al., 1992)。研究者因此推测HCV多蛋白的翻译是不依赖于5'帽子结构的，且不从第一个AUG起始，而是从内部的AUG起始。5'UTR的IRES功能为后来很多工作所证实（Tsukiyama-Kohara，et al., 1992; Wang, et al., 1993; Fukushi, et al., 1994; Rijnbrand, et al., 1995）。比如，Tsukiyama-Kohara，et al. （1992）在体外翻译系统中发现，含大部分5'UTR的mRNA从第四个AUG开始翻译，且5'帽子结构不影响其翻译效率；而当大部分5'UTR序列被缺失以后，5'帽子能大大提高HCV mRNA的翻译效率。几乎全长的5'UTR为核糖体内部起始所必需（Fukushi, et al., 1994; Rijnbrand, et al., 1995）。不改变读码框的插入、缺失和无义突变等实验表明，编码HCV核心蛋白N末端的序列也是IRES的组成部分（Honda, et al., 1996; Reynolds, et al., 1995, Zhao, et al., 1999），然而有人发现纯化的核糖体40S亚基能特异结合不含有HCV核心蛋白编码序列的HCV IRES（Pestova, et al., 1998），这样编码核心蛋白的序列可能只是有利于IRES二级结构的形成。 核心蛋白：重要的结构蛋白，且具有很多重要的非结构功能     将HCV多蛋白的疏水性轮廓和黄病毒及瘟病毒进行比较，结合体外表达研究，人们将多蛋白N末端191个氨基酸定名为核心蛋白（Hijikata, et al., 1991a; Grakoui, et al., 1993a）。一般认为宿主信号肽酶将其从多蛋白上切割下来。核心蛋白的N末端富含碱性氨基酸且高度保守，这和它的重要功能是相一致的。核心蛋白的这一部分负责结合RNA，此功能被定位于氨基酸1-75（Santolini, et al., 1994）。和核心蛋白的功能相符合，HCV核心蛋白能够形成自聚体，使用类似的方法对该功能的定位得出不同的结果：酵母双杂交系统和缺失分析将此功能定位于aa36-91（Matsumoto, et al., 1996）；电泳、酵母双杂交系统、质谱和凝胶过滤色谱分析表明负责核心蛋白自结合的结构域位于蛋白羧端（Yan et al., 1998）。     多年来的研究发现，HCV核心蛋白的成熟形式并非终止在以前认定的aa191。在两种体外哺乳动物表达系统，即痘苗病毒系统和CHO稳定表达株表达系统中均发现HCV核心蛋白的两种形式：一种终止在aa191(p23, 23kD)，另一种终止在aa174和aa191之间(p21, 21kD)。分析从HCV病人血清中分离得到的HCV核心蛋白，表明p21是天然病毒颗粒的组成部分（Yasui, et al., 1998）。     核心蛋白同时定位于细胞质和细胞核。p23的C末端疏水区是包膜蛋白E1转位至ER的信号肽。去除此疏水区使核心蛋白进入细胞核成为可能。核定位信号位于核心蛋白的N末端（Chang, et al., 1994）。已发现HCV核心蛋白调控很多基因的转录，如p53等肿瘤相关基因（Ray, et al., 1995; Ray et al., 1997），一些细胞周期相关基因(Ray et al., 1998a)和细胞凋亡相关基因(Shrivastava et al., 1998; You, et al., 1999)。核心蛋白对转录的调控有直接和间接两种模式。定位于N末端的转录抑制因子结构域用于直接模式(Ray, et al., 1999)。HCV核心蛋白对I-κB降解的调控、对JNK (c-Jun N-terminal kinase)活性的调控则间接地抑制了很多重要基因的转录（Shrivastava et al., 1998; You, et al., 1999）。还发现核心蛋白和转录调节因子hnRNP K (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K)之间有蛋白-蛋白相互作用，结合hnRNP K的位点定位于aa25-91（Hsieh, et al., 1998）。     核心蛋白对转录的调控可能与HCV致病机理有关（如肝癌）。通过对一些重要基因进行转录调控，HCV核心蛋白能抑制fas-和TNF-α介导的细胞凋亡（Ray, et al., 1998b; Marusawa, et al., 1999）。细胞凋亡是机体抗病毒感染的重要手段（Thompson, 1995; Nagava, 1997），阻断细胞凋亡可能有利于病毒在细胞中建立持久感染，因而可能是丙型肝炎慢性化的机制之一。已发现很多病毒蛋白能抑制细胞凋亡（Wang, et al., 1995; O'Brien, 1998; Shisler and Gooding, 1998）。有研究表明HCV核心蛋白能转化原代大鼠胚胎成纤维母细胞（Ray et al., 1996），表达HCV核心蛋白的小鼠细胞株BALB/3T3 A31-I-1的生长失去接触抑制（Tsuchihara, et al., 1999）。更在HCV核心蛋白基因转基因鼠中观察到肝癌的发生（Moriya, et al., 1998）。 核心蛋白的致癌能力使人们对它用于疫苗的研究产生怀疑，尽管核心蛋白含有很多体液免疫表位和CTL表位。有关核心蛋白的另一发现加强了这一怀疑：用多种结构的重组HCV-痘苗病毒感染小鼠发现，HCV核心蛋白具有免疫抑制作用（Large, et al., 1999）。     此外，这个多功能的蛋白还被发现参与抑制宿主细胞中mRNA的翻译（Mamiya, et al., 1999）。 E1     HCV多蛋白上氨基酸192到383编码HCV第一个包膜蛋白E1。信号序列aa174到191引导E1共翻译地转膜至内质网中（Hijikata, et al, 1991a）。基因表达的E1都定位于内质网膜上。和大部分定位于内质网膜的蛋白不同，此蛋白不含有KDEL或KKXX定位信号，其糖链也未经高尔基酶修饰，因而其滞留于内质网膜的机理与众不同，不是使用从顺式高尔基体拯救的机制，而是静态滞留于内质网。静态滞留信号位于E1的穿膜结构域aa311到383（Cocquerel, et al., 1999; Flint, et al., 1999）。E1是一个高度N-糖基化的蛋白，预测的N-糖基化图式位于aa196, 209, 234, 305和325，但突变分析表明第五个糖基化位点并不发生糖基化（Meunier, et al., 1999）。E1的穿膜结构域（TMD）具膜活化的特性，能改变E.coli的细胞膜透性，引起细胞的快速裂解（Ciccaglione, et al., 1998）。这可能是用E.coli表达E1的困难所在，缺失TMD后表达E1获得了成功（Yan, et al., 1994）。     普遍认为在天然状态下E1和包膜蛋白2（E2）形成非共价的聚合物。E1的N末端负责和E2的N末端结合（Yi, et al., 1997）。又发现抗核心蛋白的抗体能将E1和核心蛋白共沉淀，利用缺失作图的方法发现它们相互作用的位置均在蛋白的C末端（Lo, et al., 1996），作者同时发现E2不能和核心蛋白共沉淀，可能核心蛋白和E2之间不存在直接的相互作用。     E1的C末端同时还是包膜蛋白2（E2）的信号序列，引导E2转膜至内质网。 E2和p7     E2有两种形式，两者起始于aa384，终止于aa746或aa809，后者被认为是在aa746/aa747位点加工不完全的产物（Lin, et al., 1994a; Mizushima, et al., 1994b）。p7就是 aa747-aa809，目前还没有发现其有何功能。两种形式的E2都是高度糖化的蛋白，糖链约占E2分子量的一半。HCV膜蛋白在真核表达系统中的高效表达加工需要共表达上游的核心蛋白和下游的非结构蛋白NS2（Matsuura, et al., 1994）。在Sf9昆虫细胞中表达E2羧末端缺失的结构C-E1-E2p(1-660)，结果得到很多分子量各异的，加工不完全的膜蛋白产物，它们反应了E1/E2和C/E1位点低效率的切割（Wang, et al., 1997）。人们观测到的基因工程表达的E2分子量相差很大，从58kD到75kD，原因包括：不同的表达系统翻译后加工不同，如酵母和哺乳动物的糖基化的差异；人们使用的不同的HCV基因型可能产生的影响；人们用于检测表达的抗体所识别的表位不同，与不同的膜蛋白形式的反应性不同。     在所有HCV蛋白中，E2的保守性最弱。在E2的N末端有两个高变区（HVR），分别是HVR1（aa390-410）和HVR2（aa474-480）（Hijikata, et al., 1991b; Weiner, et al., 1991）。有证据表明E2蛋白是免疫反应的主要目标。当HCV病人接受干扰素治疗时，E2的突变增加，对于E1没有此现象发生(Zonaro, er al, 1994)；在慢性感染过程中，观察到HVR1序列在不断改变，针对HVR1序列的特异抗体也相应地不断改变（Shimuzu, et al., 1994）；E2含有两个以上中和抗体表位（Lechner, et al., 1998），其中一个位于HVR1（Zibert, et al., 1995）。哺乳动物系统表达的E2还被观察到和人细胞有特异的结合（Rosa, et al., 1996）。因此E2成了HCV疫苗开发的主要目标。     和E1类似，位于E2羧端的TMD负责E2在内质网的静态滞留（Duvet, et al., 1998; Cocquerel, et al., 1998）。共表达的E1和E2形成非共价的异二聚体，在结合E1时起主要作用的序列位于aa415-500，两个HVR对于结合E1没有贡献（Yi, et al., 1997）。     有了这些背景，当人们发现E2和细胞表面分子CD81之间的强烈的相互作用，并且，含保护性抗体的血清能阻断E2和CD81的相互作用时（Pileri et al., 1998），很多人便相信CD81是HCV受体分子，尽管没有证据表明HCV和CD81的结合导致病毒进入细胞。反而是有证据表明，HCV和其他黄病毒家族成员结合并通过低密度脂蛋白（LDL）受体进入细胞（Agnello, et al., 1999; Monazahian et al., 1999）：自由LDL能竞争性地阻断HCV和细胞的结合；原来不结合HCV的细胞在表达LDL受体后能结合HCV；提高LDL受体活性后观察到HCV等病毒的内吞也相应提高；并在体外实验中对多种细胞使用抗LDL受体抗体完全阻断了HCV的内吞。但是，用抗LDL受体抗体处理LDL受体缺陷的成纤维母细胞后，仍有少量HCV能进入细胞。看来抗LDL受体是介导HCV入胞的主要受体，但不是唯一受体。     利用多种凝集素亲和柱对从病人血清中分离到的不同基因型的天然病毒粒子进行分析，发现所有基因型的病毒粒子表面的糖基都是N-连接的复杂糖型的糖链，这是在高尔基体被修饰的结果（Sato, et al., 1993）。这似乎和E2静态滞留于内质网膜有矛盾。Bartenschlager等提出的HCV复制模型（图2）将静态滞留于内质网膜的E2和病毒颗粒上经高尔基体修饰的E2联系了起来 （Bartenschlager, et al., 2000）。我们的实验结果支持该模型提出的HCV向内质网出芽而非向细胞膜出芽。在痘苗病毒表达系统中单独表达包膜蛋白只能得到糖化较少的E2蛋白，共表达核心蛋白则能得到75kD的高度糖化的蛋白。构建了多个缺失突变克隆，发现高度糖化E2的表达依赖于全长的核心蛋白序列，而E1的共表达则不是必需的（Zhu, et al., 2000）。其原因可能是共表达的核心蛋白能和内质网膜上的E2蛋白结合，形成假病毒颗粒，从而才能脱离静态滞留内质网膜信号的束缚，进入高尔基体得到进一步的糖化。 图2：HCV复制周期的假说模型。     感染宿主细胞（大方框）后，正链RNA基因组被释放至细胞质，以之为进行翻译。继而所得的多蛋白被加工，病毒蛋白与内质网膜紧密联系。表达产物中的复制酶NS3-5合成负链RNA并以之为模板合成大量的正链RNA。正链RNA然后和核心蛋白相接触并被包裹为核心颗粒。此颗粒向内质网出芽形成病毒颗粒。病毒颗粒经高尔基体由分泌途径出胞。 看来E2蛋白也不仅仅是一个结构蛋白，它可能是HCV对干扰素的抗性的原因之一 (图3)：E2被发现与INF诱导的蛋白激酶PKR（double-RNA activated protein kinase）有结合。后者催化转录起始因子eIF2-alpha的磷酸化，从而下降调节蛋白合成。在表达E2蛋白的细胞中，PKR被抑制，使得在INF存在时翻译照常进行（Taylor et al., 1999）。 图3，HCV蛋白对干扰素治疗的拮抗作用 非结构蛋白2（NS2）     NS2是一个23kD的疏水膜蛋白（Santolini, et al., 1995），包含了多蛋白上的氨基酸序列aa810-1026，是蛋白酶NS2-3的组成部分。宿主信号肽酶催化p7/NS2之间的切割（Mizushima, et al., 1994a），而NS2羧端的切割由NS2自身和非结构蛋白3（NS3）丝氨酸蛋白酶结构域的一部分共同催化，缺失作图将此催化活性定位于氨基酸827和1207之间（Grakoui, et al., 1993b）。NS2-3的这个自催化活性是依赖于锌元素的（Hijikata, et al., 1993）。NS2-3蛋白酶和NS3丝氨酸蛋白酶之间的活性是相互独立的，因为NS2上单个氨基酸突变可以使NS2-3蛋白酶失活，却不影响NS3丝氨酸蛋白酶的活性；另一方面，NS3丝氨酸蛋白酶的突变也不影响NS2/3之间的切割加工（Grakoui, et al., 1993b; Hijikata, et al., 1993）。 NS3和非结构蛋白4A（NS4A）     NS3对应HCV多蛋白aa1027到1657。根据NS3的保守序列花式，它应含有NS2-3蛋白酶活性，丝氨酸蛋白酶活性，解旋酶活性和NTPase活性。     作图分析结果表明，丝氨酸蛋白酶活性位于NS3的N末端1/3处，相应于HCV多蛋白aa1027至1207，突变研究表明它催化了NS3/4A，4A/4B，4B/5A和5A/5B的切割（Bartenschlager, et al., 1993; Bartenschlager, et al., 1994; Lin et al., 1994b）。用两种重组痘苗病毒感染细胞，其中一病毒编码NS3蛋白酶失活的NS3-5，另一病毒编码活性的NS3蛋白，发现NS4A/4B，NS4B/NS5A和NS5A/5B能被反式切割，而NS3/4A则不能。稀释不影响NS3/4A的加工证实了NS3/4A的切割是一个分子内的反应。在非结构蛋白的加工动力学研究中没有观察到含NS3的前体，提示在NS2/3和NS3/4A处的加工很迅速，而很多NS4A-NS5B的加工中间物显示其切割加工效率很低。三个高度保守的氨基酸His1083, Asp1107和Ser1165被认为组成了丝氨酸蛋白酶家族典型的催化三联体（Miller, et al., 1990; Bazan, et al., 1988）。     NS4A对应于HCV多蛋白的aa1658至aa1711，由一个非常疏水的N末端和亲水的C末端组成。它是NS3丝氨酸蛋白酶的辅助因子，和NS3一起催化HCV非结构蛋白的酶解加工。NS4A的疏水特性对NS3/NS4A蛋白酶在膜上的定位及其稳定性可能有贡献。NS4A对于NS3/4A和4B/5A之间的切割是必需的，它对于NS4A/4B和5A/5B位点的切割则有促进作用（Failla, et al., 1994）。X-光结晶图像分析显示，结合NS4A显著改变了NS3的构象（Kim, et al., 1996）。作图分析表明NS3的N末端22个氨基酸对于NS3-NS4A的结合很重要（Satoh, et al., 1995），相应地NS4A上负责它们结合的区域位于第21至34位氨基酸（Shimizu, et al., 1996）。由于它们在HCV多蛋白加工中的重要功能，这两个蛋白成了发展抗病毒药物的目标。     NS3的羧端带有RNA解旋酶活性以及NTPase活性（Kim, et al., 1995）。病毒需要解旋酶的原因可能包括：1，在病毒复制及转录时解开双链RNA；2，在病毒蛋白的翻译过程中梳理核糖体前的二级结构。和其他解旋酶一样，NS3解旋酶具有内在的NTPase活性，通过水解NTP为解旋酶提供能量。有证据显示，NS3和NS4A都能分别和NS5B形成复合物，支持它们都是HCV复制复合物的组成部分（Ishido, et al., 1998）。     研究发现这个HCV解旋酶还具有DNA解旋酶活性（Tai, et al., 1996），此活性可能影响宿主细胞活性并在丙型肝炎病理上起作用。在NIH3T3细胞表达NS3时观察到细胞被转化，并在裸鼠里长出了肿瘤。作图分析将此转化活性定位于NS3的N末端，包括丝氨酸蛋白酶结构域和部分的解旋酶/NTPase结构域（Sakamuro, et al., 1995）。 非结构蛋白4B（NS4B）     NS4B，跨HCV多蛋白aa1712-aa1972(27kD), 是一个非常疏水的蛋白。目前所知的NS4B的功能只有一个。它和NS3以及NS4A一起，为非结构蛋白NS5A的高度磷酸化所必需；NS5A要从p56形式转变为高度磷酸化的p58形式，要求NS3，NS4A，NS4B和NS5A被编码在一个多蛋白上（Neddermann, et al., 1999; Koch, et al., 1999）。 NS5A     通过和其他病毒的比较，NS5A（aa1973-aa2420, p58）以及NS4B被预测为复制酶的重要组成成分。NS5A被发现和一个膜结合蛋白hVAP-33（ human vesicle-associated membrane protein-associated protein of 33 kDa）有特异的结合，同时hVAP-33还和HCV的RdRp（NS5B）相结合。NS5A和NS5B分别和hVAP-33的羧端和氨端结合（Tu, et a., 1999）。此结合进一步提示NS5A是复制酶的组成部分并提示了复制酶在膜上定位的机制。     NS5A的两种形式p56和p58均为磷酸化蛋白，尤其后者为高度磷酸化蛋白。磷酸化暗示了此蛋白具有重要功能，比如在信号传导、转录调控、细胞凋亡等行为中起作用。     NS5A具有多个脯氨酸富集区域，能和细胞信号分子的SH-3结构花式相结合，免疫印迹的方法显示NS5A和生长因子受体结合蛋白2（Grb2）有特异的结合，Grb2上SH-3的点突变能去除Grb2结合NS5A的能力。同样利用突变方法，证实了和SH-3结合的区域是NS5A的脯氨酸富集区域（Tan, et al., 1999）。NS5A可能通过此途径干扰细胞信号传导（如对ERK1/2磷酸化的抑制，ERK：受细胞外信号调控的激酶），这可能是HCV的致病机制之一。     有研究表明NS5A可能抑制p21WAF1的转录（Ghosh, et al., 1999）， p21WAF1是细胞周期调控因子。利用酵母双杂交系统，发现NS5A和细胞转录因子SRCAP的羧端有特异结合，此结合为哺乳动物双杂交分析、免疫共沉淀等实验所证实（Ghosh, et al., 2000a）。因此NS5A可能通过SRCAP间接进行转录调控。     NS5A调控细胞凋亡的证据是它能抑制TNF-α引起的细胞凋亡。NS5A被发现能阻断caspase-3的激活，并抑制死亡底物poly (ADP-ribose) polymerase的酶解（Ghosh, et al., 2000b）。     在研究基因型对治疗的影响时发现，NS5A在HCV对α干扰素的抗性中起作用，此抗性位于HCV多蛋白aa2209-aa2248 (Enomoto, et al., 1995; Enomoto, et al., 1996)。 病人携带的HCV序列在此区段属1b基因型时，对干扰素治疗几乎无反应。此抗性的分子机制还不清楚。但有证据表明NS5A是PKR的有效的抑制因子（Gale, et al., 1997），而PKR是干扰素诱导的蛋白激酶，它催化真核翻译起始因子2的 α亚单位的磷酸化，造成蛋白合成的终止以及被感染细胞的死亡（图3）。 非结构蛋白5B（NS5B）     根据和其他病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）顺序的同源性比较，HCV多蛋白 aa2421-3011被指定为HCV的RdRp，即复制酶复合物最重要的成份，在真核体外表达系统表达产物大小为68kD，即p68（Choo, et al., 1989）。缺失突变分析表明NS5B的N末端负责结合RNA（Ishii, et al., 1999）。杆状病毒表达的NS5B在体外系统中显示了RdRp活性，证实了上述的推测（Behrens, et al., 1996）。进一步的生化和酶动力学分析表明(Lohmann, et al., 1998)：1，NS5B受KCl或高浓度的NaCl抑制；2，NS5B的活性依赖于Mg离子，Mg离子也可被Mn离子所代替；3，NS5B持续性地合成RNA，在22°C的延长速率为150-200nt/min；4，以HCV基因组最后319nt为模板，NS5B对四种核苷酸底物的动力学常数Km值为UTP（约1.0μM）, GTP（约0.5μM）, ATP（约10μM）, 和 CTP（约0.3μM）。     单链RNA的复制过程要求RdRp具有引物酶活性或者在复制起始时它能利用某个特异的引物。in vitro 实验表明NS5B能使用模板的3'末端羟基作为引物；而如果模板3'末端被封闭或者模板是一个单调的多聚核苷酸，NS5B起始复制时需要特定的寡聚核苷酸引物。这表明NS5B没有内在的引物酶活性（Behrens, et al., 1996; Lohmann et al., 1997）。 3'UTR     3'UTR的5'端约30nt的片段是一个基因型特异的多变区，不同基因型之间有核苷酸序列的差异。紧接着是一个多聚U区域，不同基因型的HCV的多聚U有不同的长度。然后是一个多聚嘧啶C（U）区域，最后是一段高度保守的98碱基的区域（Kolykhalov, et al., 1996; Tanaka, et al., 1996），被称为X区域。高度保守的3'末端暗示了3'UTR的重要功能。通过和其他RNA病毒相比较，推测这个高度保守的98碱基序列可能和病毒基因组的包装有关系，也可能参与RNA合成起始，或对两者都很重要。从具有感染力的cDNA克隆及其3'UTR的缺失突变株制备RNA转录本，用猩猩来测试感染性，发现多聚U、多聚C（U）或X区域的部分或全部缺失都使RNA转录本丧失了感染性；而破坏了5'端多变区2个茎环结构的缺失却对RNA的感染性没有影响（Ynangi, et al., 1999）。     3'端多聚A能增强真核mRNA的翻译。HCV的RNA没有多聚A尾巴，但它的3'端X区域被发现具有类似的作用。X-区域具高度保守的茎环结构，能结合一种多聚嘧啶结合蛋白（PTB）。PTB恰能与5'UTR的IRES相结合。缺失突变分析表明，含有X区域的RNA的翻译水平比没有X区域的RNA要高2到4倍，使X区域丧失结合PTB能力的突变降低但没有完全丧失X区域对RNA翻译的增强。X区域对翻译的增强被发现为顺式作用，且能增强另一依赖IRES的翻译，即脑心肌炎病毒RNA的翻译，而对5'加帽的mRNA的翻译没有增强（Ito, et al., 1998）。 结语     HCV的RNA基因组编码了一个ORF和两个具重要功能的UTR。5'UTR编码IRES，3'UTR可能含有RNA包装或/和复制所需的重要序列。ORF翻译产生的一个多蛋白被蛋白酶切割为十个蛋白质。N末端是三个结构蛋白：核心蛋白和包膜蛋白E1，E2，由宿主编码的信号肽酶从多蛋白上切下。现已知随后的非结构蛋白区编码了四种酶活性：1，自切割蛋白酶NS2-3和NS3氨端丝氨酸蛋白酶，后者切割3/4A，4A/4B，4B/5A和5A/5B位点。NS4A是NS3重要的辅助因子。2，NS3的RNA解旋酶。3，NS3的NTP酶。4，NS5B编码的RdRp。目前在开发抗病毒药物是都是以这些重要的功能蛋白以及UTR的保守序列为目标。在HCV的生长周期中，p7、NS4B和NS5A的功能尚不明确，其它蛋白的功能也需在HCV复制系统中得到进一步证实。     HCV感染是慢性肝炎的最主要的致病因子，并且引起肝硬化和肝癌。一般认为HCV的核心蛋白能转化细胞引起癌症，其致病机理可能和核心蛋白调控转录的能力有关。NS3也被发现有转化能力，此转化能力可能来源于NS3的DNA解旋酶活性。磷酸化蛋白NS5A对信号传导的干扰、对基因转录、细胞凋亡的调控也可能对HCV的致病性有贡献。阐明它们转化细胞、影响细胞生命活动的机制将有助于抗HCV药物的开发，并增进我们对生命现象中信号传导、转录调控、细胞分化和发育的认识。     有证据显示HCV编码的核心蛋白、E2和NS5A能抑制宿主的免疫反应。可能免疫抑制和HCV的高突变率都是HCV慢性化以及HCV免疫逃避的重要原因。感染HCV的病人大约有25%能自动清除体内病毒（Paliago, et al., 1999）。有证据表明这是机体产生了较强的体液或细胞免疫反应所致（Choo, et al., 1994; Cooper, et al., 1999）。因此，在疫苗开发和抗病毒药物开发的同时，研究HCV对宿主免疫抑制的机理，以期采取避免宿主免疫系统被抑制，激活、提高宿主本身对HCV的抵抗力，也许能为HCV的治疗和预防开辟一条新路。 文献 1. 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