姬松茸多糖的抗肿瘤活性

姬松茸多糖的抗肿瘤活性 福建农林大学(自然科学版) JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition) 第39卷第4期 2010年7月 姬松茸多糖的抗肿瘤活性 郑亚凤,黄志伟,陈瑞庆,郑金贵 (1.福建农林大学农产品品质研究所,福建福州350002;2.福建 医科大学附属第一医院中心实验室,福建福州350003) 摘要:通过构建小鼠s.粕荷瘤模型,对姬松茸多糖含量最高的品种AB01的多糖(AB01一P)和含量最低的品种AB03的多糖 (AB03.P)的抗肿瘤效果进行了研究.结果明:AB01一P有极显着的抗肿瘤活性,并与剂量呈正相关,高剂量组(2.0mg? mL)的抑瘤率为45.36%;AB03一P的抑瘤率最高为25.14%.与对照组相比,AB01一P可极显着地提高Slso荷瘤小鼠的胸腺 指数和脾脏指数.采用AnnexinV/PI双染色流式细胞仪研究了AB01一P对人骨肉瘤细胞株MG/63早期凋亡的影响,发现 AB01.P对诱导MG/63细胞凋亡有一定的作用,且具有量效关系,2.0mg?mL剂量组的凋亡率为30.98%. 关键词:姬松茸;多糖;抗肿瘤;细胞凋亡;AnnexinV/PI 中图分类号:$646.9文献标识码:A文章编号:1671-5470(2010)04一D4o9JD4 Anti-tumorfunctionsofAgaricusblazeip0lysaccharide ZHENGYa—feng,HUANGZhi—wei,CHENRui—qing,ZHENGJin—gui (1.AgriculturalProductQualityInstitute,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzho u,Fujian350002,China; 2.CentralLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou,Fuji an350003,China) Abstract:ThroughsettingupmouseS180tumor-beatingmodels,wecarriedouttheresearcho ntheanti—tumorfunctionsoftheAgari— cblazeiMurrillpolysaccharide(AB01一 P)fromfermentationliquidofAB01(thevarietywiththehighestpolysaccharidecontent), AB03.PfromfermentationliquidofAB03(thevarietywiththelowestpolysaccharideconten t).AB01一Phasobviousfunctiononthe suppressionoftheSl加 tumorSactivity,relatingwiththedosagepresent.HighdosagegroupStumorsuppressionrate was45.36%, whichWaShigherthanAB03一 PShighestrate25.14%.Comparingwiththecontrolgroup,ABO1一 Pextremelyobviouslyenhancedthe S180tumor.bearingmousesthymusindexandthespleenindex.WeusedAnnexinV/PIdoubl edyeingflowcellso~ertostudythe influenceontheearlydeathofhumanusteosarcomacellline(MG/63)byABO1一 P.TheresultsindicatedthatAB01-Pinduced MG/63celldeath.relatingtothedosagepresent.Thegroupof2.0mg?mL, hadthedeathrate30.98%. Keywords:Agaricusblazei:polysaccharide;anti—tumor;celldeath;Annexin,PI 姬松茸(AgaricusblazeiMurriH)原产于南美巴西等地,大量的化学和药理分析发现, 其多糖具有很强的 抗肿瘤活性,同时还具有提高机体免疫力…,降低血糖等药用价值,是一种珍稀食 药兼用菌.在日本,以子 实体为研究材料的食用菌中,姬松茸的抗肿瘤效果位居首位j,抑瘤效果达到99%], 姬松茸深层发酵生 产的菌丝体及滤液中同样含有抗肿瘤活性成分,主要成分为多糖及其蛋白质复合 体H].一般食用菌抗癌 都是通过注射,口服不能显示抑癌效果,但姬松茸口服也不逊于注射的效果J.作者 研究了国内27份姬松 茸种质资源,筛选出多糖含量最高的品种AB01(多糖含量达2.05mg?mL)和最低的品种AB03(多糖含 量为O.6lmg?mL).本试验对ABO1,AB03这2个姬松茸品种进行深层发酵,提取发酵全液多糖进行了 体内,外抗肿瘤研究. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1供试样品调节姬松茸AB01,AB03发酵全液的pH至7.5,微波处理后于100?浸提,抽滤,浓缩, 用95%乙醇(4?)沉淀,离心,冻干,得到多糖AB01一P和AB03.P.样品均为淡黄色粉末,溶于水.用于处 收稿日期:2008—04—10修回日期:2010—05—28 基金项目:国家转基囡生物新品种培育重大项目(2009ZX08001-032B);福建省科技厅重大项目(2008NZ0001-4);福建省科技创新平台建设 项目(2007S1001).', 作者简介:郑亚风(1981一),女,讲师,博士.研究方向:农产品品质生物技术.通讯作者郑金贵(1949一),男,教授,博士生导师.研究方向:农 产品品质.Email:jgzheng@au.edu.cn. ? 41O?福建农林大学(自然科学版)第39卷 理细胞时,先经0.22m滤膜过滤除菌. 1.1.2受试动物和细胞株昆明小鼠体重(20?2)g,雌雄兼用,SPF级,由福建医科大学动物实验中心提 供;移植性肿瘤$18o腹水型小鼠,购自福建医科大学动物实验中心;人骨肉瘤细胞株MG/63由福建医科大 学附属第一医院中心实验室提供,置含10%小牛血清(FBS)的RPMI1640培养液(饱和湿度)中,于37 ?,5%CO培养箱培养,3—4d传代一次. 1.1.3试剂与仪器注射用环磷酰胺(Cy)为江苏恒瑞医药股份有限公司产品;细胞培 养的RPMI1640培 养基为美国GIBCO公司产品;新生小牛血清为上海华美生物工程公司产品;磷酸缓冲液(PBS):含8g NaC1,0.2gKC1,1.44gNa2HPO4,0.24gKH2PO4,1000mLH2O,用盐酸调节pH至7.4,灭菌,常温下保存; AnnexinV—FITC试剂盒购自BECKMAN公司;流式细胞仪(COULTEREpicsXL) 为BECKMAN公司产品. 1.2体内抗肿瘤试验 1.2.1小鼠s加荷瘤模型的建立S印细胞经传代培养后,在细胞的指数生长期收集细胞,于1000r? rain离心5min,用PBS洗涤2次,离心去上清液,用无菌生理盐水稀释,调整细胞数量至(2—3)X10? mL,.随机选取5只健康小鼠,每只腹腔注射0.5mL上述细胞悬液.注意观察接种小鼠的腹水生长情况, 约一周后接种小鼠的腹部明显胀大,凸出,无菌抽取腹水,腹水呈乳白色,稍浑浊.在无菌试管中用无菌生理 盐水以1:2的比例稀释,用上述腹水稀释液对小鼠进行接种,每只小鼠右前肢腋皮下接种0.3rnL稀释液【6J. 1.2.2试验动物分组与多糖剂量设定将小鼠随机分组为AB01.P低剂量组(50mg?kg),中剂量组 (100mg?kg)和高剂量组(zoomg?kg),AB03?P低剂量组(50mg?kg),中剂量组(100mg?kg) 和高剂量组(200mg?kg),另设对照组和cy组,分别灌胃等量生理盐水和20mg?kg,Cy,每组8只. 接种后于24h内灌胃,连续10d.小鼠自由进食与饮水. 1.2.3抑瘤率的测定停药24h后脱颈椎处死老鼠,仔细消毒皮肤后,小心切开肿瘤表面皮肤,充分暴露 瘤块组织,沿肿瘤包膜小心剥离肿瘤组织.将剥下的瘤块置于无菌纱布上吸尽瘤块周围残留血迹,称取并 记录瘤重.肿瘤生长抑制率/%=(对照组平均瘤重一给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100. 1.2.4免疫器官指数的测定小鼠剥离瘤块后,取出脾脏及胸腺,称重,计算脾脏指数和胸腺指数. 脾脏指数/(mg?g)=脾脏平均重量/平均体重;胸腺指数/(mg?g)=胸腺平均重量/平均体重. 1.3体外抗肿瘤试验 1.3.1入骨肉瘤细胞的培养将MG/63细胞传代在含10%小牛血清的RPMI1640培养液中,置饱和湿 度,37?,5%CO培养箱中培养1d后加入经O.22m过滤除菌的AB01.P多糖(高剂量组含量2.0mg? mL,,中剂量组含量1.0mg?mL,,低剂量组含量0.5mg?mL),并设置空白对照组,继续培养48h. 1.3.2细胞早期凋亡的测定培养细胞经胰酶消化,离心,PBS洗涤,制成单细胞悬液,调整细胞数量为 ×10.?mL,. 1 每100iLL细胞悬液加入5LAnnexinV—FITC和2.5L碘化丙啶(PI),混匀后,冰上避光 15min,加入400txL预冷的Binding缓冲液,轻柔混匀.30min内用流式细胞仪. 1.4数据分析 数据用平均数?差表示,采用DPS3.0l统计软件进行分析. 2结果与分析 2.1姬松茸多糖的抗肿瘤活性 姬松茸多糖AB01.P和AB03一P体内抗肿瘤的试验结果见表1.除肿瘤对照组死亡一只鼠外,其余各组 均未出现死亡;在试验剂量下,AB01一P对S肉瘤的抑制率为30.60%一45.36%,且呈剂量效应关系,各剂 量组均能极显着抑制肿瘤生长;AB03一P对S?肉瘤的抑制率为13.66%一25.14%,同剂量下AB03一P的抑 制率低于ABO1.P;Cy组的抑瘤效果最好,但对小鼠体重增长有明显的影响,而AB01一P和AB03一P各剂量 组对小鼠体重增长均无明显影响. 第4期郑亚凤等:姬松茸多糖的抗肿瘤活性?411? .)/2=8;}表示P<O.05,表示P<O.O1. 2.2姬松茸多糖对$18o肿瘤小鼠免疫器官的影响 由表2可知,对照和cy组S1so肿瘤小鼠的胸腺指数,脾脏指数明显低于AB01.P和AB03一P给药组,这 与肿瘤及Cy损害机体免疫功能的结论一致.ABO1一P和AB03一P可显着提高小鼠的胸腺指数,差异达极显 着水平(P<0.01),且AB01一P各剂量组药效均优于AP03.P各剂量组.AB01.P和AB03一P各剂量组的脾脏 指数均高于对照组,除100mg?kg,?d,AB03一P组达显着差异外,其他组均达极显着差异.可见,姬松 茸多糖可以提高肿瘤小鼠机体非特异性免疫能力,增强防病抗病能力. 表2姬松茸多糖对S.舯肿瘤小鼠免疫器官的影响 Table2EffectsofpolysaccharidesfromA.blazeionimmuneorganinSl80tumormice )n=8;表示P<O.05,表示P<0.01. 2.3姬松茸多糖对MG/63细胞早期凋亡的影响 图I表明:MG/63细胞经AnnexinV/PI双染色流式 细胞仪检测,未经AB01一P处理的MG/63细胞48h后凋 亡细胞极少(3.09%);经0.5,1.0,2.0mg?kg,AB01一P 处理48h后,凋亡率分别为11.13%,25.73%和 30.98%,明显高于对照组3.09%.AB01一P处理组的死亡 细胞数量与对照组无明显差别. 3讨论 真菌多糖具有明显的抗肿瘤作用j,云芝多糖,茯 苓多糖,香菇多糖等已经在临床上用于治疗肿瘤.真菌 多糖的抗肿瘤作用机制主要有2种:一是真菌多糖具有 细胞毒作用,直接作用于肿瘤细胞而抑制其增殖;二是 作为生物反应调节剂,通过提高宿主的免疫功能而间接 OO.51.02.0 AB01.P/(mg?mL) 图1AB01-P对MG/63细胞凋亡的影响 Fig.1ApoptosisofMG/63ceilsdetectedbyAnnexinV/PI 发挥其抗肿瘤作用.本试验结果表明,姬松茸AB01与AB03相比,其多糖经口服,对$18o肿瘤小鼠有极 显着的体内抗肿瘤作用,并与剂量呈正相关,而AB03.P的抗肿瘤作用明显低于AB01一P.可见,姬松茸多糖 的抗肿瘤作用可能与其含量和组分差异有关. 如加巧m0 ? 4l2?福建农林大学(自然科学版)第39卷 免疫器官重量是反应机体非特异性免疫功能的重要指标,免疫抑制剂可造成人或动物免疫器官重量 下降或功能低下,而免疫促进剂可使免疫器官重量恢复至正常水平9】.胸腺和脾脏是机体重要的免疫器 官,胸腺主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素,从而可以调节细胞免疫功能;脾脏中也含有丰富的淋 巴细胞和巨噬细胞,它们都参与免疫反应.cy是肿瘤治疗中常规使用的化疗药物,但cy对小鼠免疫器官 重量的影响很大,对机体免疫功能有损害作用.本试验结果表明,与对照组相比,姬松茸AB01多糖可极显 着地提高Slso肿瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数,从而促进非特异性免疫功能和细胞免疫功能.姬松茸多糖 可能是通过增强免疫功能达到抑制肿瘤的目的, 近年来研究表明,细胞凋亡与肿瘤发生,发展和消退有密切关系,大多数抗肿瘤药物能诱导肿瘤细胞 凋亡,且抗肿瘤的强弱与它们诱导肿瘤细胞凋亡的活性呈正比J"J.因此,诱导肿瘤细胞凋亡已成为评价 药物疗效的新指标.本试验观察了姬松茸AB01多糖诱导MG/63细胞的凋亡,试图从凋亡角度来阐明其 抗肿瘤机制.AnnexinV/PI法较其他方法可更好地区分早期凋亡,晚期凋亡及坏死细胞,是目前判断细胞 早期凋亡的常用方法.本试验通过Annexinv/PI双染色流式细胞仪对MG/63细胞进行检测,发现姬松茸 AB01多糖对MG/63细胞的凋亡有一定作用,并呈量效关系. 参考文献 [1]张龙涛,王舒宁,沈恒胜,等.姬松茸深层发酵产物对小鼠消化吸收和特异性免疫的影响[J].福建农林大学:自然 科学版,2008,37(1):80—83. 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