选择性COX2抑制剂Celecoxib预防大鼠术后腹腔粘连的实验研究

选择性COX2抑制剂Celecoxib预防大鼠术后腹腔粘连的实验研究 论文范文 目:选择性抑制剂Celecoxib预防 大鼠术后腹腔粘连的实验研究 编辑:司马小 作者:王康～李徐奇～魏光兵～徐昕～平高峰 【摘要】 目的 探讨Celecoxib对大鼠术后腹腔粘连形成的预防效果及其机制。方法 80只SD大鼠随机分为5组:接受腹膜擦损术为A组～接受腹膜擦损术+40mg/(kg〃d)Celecoxib为B组～接受腹膜擦损术+20mg/(kg〃d)Celecoxib为C组～接受腹膜擦损术+透明质酸钠凝胶为H组～仅接受开、关腹操作的假手术为S组。各组随机半数大鼠于术后第8天和15天处死～肉眼评估大鼠一般情况和腹腔粘连程度～免疫组化法粘连组织VEGF和CD34。结果 5组大鼠术后粘连程度组间差别具有显著性意义(P<0.01,～B组、C组的粘连评分均明显小于H组、A组。VEGF蛋白表达量A组最强～次之分别为H组、C组、B组～S组最弱。CD34表达量A组最强～次之分别为H组、C组、B组～S组最弱。结论 术后短期口服Celecoxib可有效预防大鼠术后腹腔粘 连形成～效果优于透明质酸钠凝胶。机制可能与抑制活性后下 调VEGF表达～抑制粘连组织新生血管发生有关。 【关键词】 腹腔粘连,环氧合酶,血管生成,Celecoxib ABATRACT: Objective To determine the preventive effect of Celecoxib on postoperative adhesion formation and its mechanism. Methods We divided 80 SD rats into 5 groups: Groups A, B, C, H and S. Rats in Groups A, B, C and H received the operation of peritoneum rubbing to promote adhesion formation. Group S underwent sham operation. Rats in Group B were given Celecoxib of 40mg/(kg〃d), those in Group C were also given Celecoxib of 20mg/(kg〃d), and those in Group H were given sodium hyaluronate (HA) during the operation. On the 8th and 15th postoperative day, half of the rats were sacrificed, the extent of adhesion formation was assessed and the adhesive peritoneum was subjected to immunohistochemistry with VEGF and CD34. Results The extent of postoperative adhesion differed significantly among the five groups (P<0.01). Groups B and C had significantly fewer adhesions than Groups H and A. VEGF was expressed most highly in Group A, followed by Groups H, C and B, and most weakly in Group S. CD34 was expressed most highly in Group A, followed by Groups H, C and B, and most weakly in Group S. Conclusion adhesions in a murine model compared with HA. The mechanism reduced microvascular density. angiogenesis; Celecoxib 术后腹腔粘连是外科腹部手术后最常见并发症。10%的粘连性肠梗 阻患者必须进行粘连松解术～且手术治疗复发率高～若无有效预防措 施～在术后41个月内就有12%的再粘连～甚至在20年后仍有相当大的 风险。曾有若干措施用于预防腹腔粘连形成～但多数效果有限。因 此～有必要对术后腹腔粘连形成的机制做进一步的研究～寻找新的预防方法。本实验通过建立术后腹腔粘连动物模型～证实选择性抑制剂Celecoxib可经抗血管生成途径预防术后腹腔粘连形成～为临床运用提供基础依据。 1 材料与方法 1.1 动物分组 大鼠80只(西安交通大学医学院实验动物中心提供,～雌雄各半～体重200，250g～随机分为40mg/(kg〃d) Celecoxib(B,组、 20mg/(kg〃d) Celecoxib(C)组、透明质酸钠(H,组、粘连(A,组、假手术(S,组5组～每组16只。各组大鼠在体重、性别上无明显差异～具有可比性。 1.2 实验方法 大鼠禁食12h～无菌条件下手术～水合氯醛(3mL/kg)腹腔麻醉～下腹正中切口约2cm入腹。无菌纱布擦拭盲肠壁及相对壁腹膜直至点状出血～面积约2cm〓2cm～空气中暴露5min～排列肠袢保证受伤腹膜与肠管对邻。B组、C组、A组动物直接关腹。H组动物在腹膜创伤处均匀涂抹医用透明质酸钠凝胶后关腹。S组动物仅进行开、关腹操作。 术后禁食不禁水24h。术后第1天～B组、C组大鼠分别予40mg/(kg〃d) Celecoxib、20mg/(kg〃d) Celecoxib灌胃～分2次给药～连续7d。其余组别给予生理盐水2mL灌胃做对照。各组大鼠于术后第8天、15天处死半数～进行观察。 1.3 观察指标 1.3.1 肉眼观察 倒“U”形切口打开大鼠腹腔～观察粘连情况～按照修正KATADA粘连评分方法进行评分。 评分包括三个方面:?粘连范围:仅涉及盲肠和腹壁损伤面～1分,另涉及切口下、小肠、网膜、肝、脾等其他区域1处～2 分,另涉及其他区域2处～3分,另涉及其他区域3处及以上～4分。?粘连强度:粘连疏松～易分离～无渗血～1分,粘连稍密～需牵拉后分离～分离面有渗血～2分,粘连致密～需较大力量牵拉后才可分离～3分,粘连很致密～较大力量牵拉后亦无法分离～4分。?粘连面积:占盲肠和壁腹膜损伤面25%以下～1分,占25%，50%～2分,占50%，75%～3分,占75%以上～4分。满分12分～无任何粘连为0分。 1.3.2 HE染色 切取粘连或损伤组织(包括一部分肠管和相对的腹膜,～100g/L甲醛固定24h后常规石蜡包埋～4μ,厚连续切片后～行常规石蜡切片HE染色。 1.3.3 VEGF、CD34免疫组化染色 标本经100g/L甲醛浸泡24h～常规石蜡包埋～4μm厚连续切片后～采用链霉亲和素免疫组化法染色:切片常规脱蜡至水～室温下30g/L过氧化氢孵育5min～滴加山羊血清封闭～加小鼠抗大鼠VEGF/CD34抗体(Santa Cruz)4?过夜～滴加生物素化兔抗小鼠IgG～孵育20min～滴加SABC～37? 20min～PBS(pH 7.2)洗5min〓4次～DAB显色～苏木精复染～脱水～透明～封片。图像信号采集与系统(Leica)采集图像～每张切片随机取5个不同高倍视野(〓400)～ 软件在同等光学条件下分析吸光度～吸光度值(A)越高表示蛋白表达量越高。 1.4 统计学分析 粘连评分以中位数〒四分位间距(median〒QR)表示～免疫组化切片阳性颗粒吸光度以均数〒标准差(〒s)表示。SPSS15.0统计软件统计分析～粘连评分采用秩和检验～免疫组化染色结果采用方差分析～组间两两比较采用检验～检验水准α=0.05。 2 结 果 2.1 大体观察 动物均无死亡～完成所有实验过程。S组有1例腹腔内感染～H组中有1例发生切口感染～各组均无切口裂开。 各组腹腔粘连程度不同(图1,。S组仅有1例在第8天时在腹壁切口与肠管之间形成一轻微粘连带～余者皆无粘连形成。A组第8天粘连以带片状为主～较难分离,至第15天～形成牢固粘连。B组第8天大部分损伤浆膜面已修复～仅2例形成轻微程度粘连～疏松易分,至第15天损伤浆膜面已完全修复。C组情况与B组相似。H组第8天肠管表面胶冻状透明质酸钠已完全吸收～大部分损伤浆膜面已修复～壁层腹膜与肠管的创面之间及网膜间存在带状粘连组织～较难分离,至第15天～已形成牢固粘连。 2.2 粘连评分 术后第8天～各组随机处死半数～对腹腔粘连评分(图1～表1)。5组大鼠(n=8)粘连程度各组间差别具有统计学意义(P<0.01)。和A组相比～B、C组均可降低大鼠术后粘连程度～而H组与A组间差别无统计学意义。术后第15天～处死剩余大鼠并予评分～5组大鼠(n=8)术后粘连程度组间差别具有统计学意义(P<0.01)。和A组相比～B、C组降低了大鼠术后粘连程度。 2.3 免疫组化染色 2.3.1 VEGF蛋白表达 VEGF蛋白阳性表达主要在粘连组织成纤维细胞的胞质中～为棕黄色颗粒(图2A、图2B)。第8天时～各组VEGF蛋白表达量差别具有统计学意义(P<0.01,～A组最强～次之分别为H组、C组、B组～S组最弱(表2、图2C,。第15天时～各组VEGF蛋白表达量差别具有统计学意义(P<0.01)～A组最强～次之分别为H组、C组、B组～S组最弱。 2.3.2 CD34蛋白表达 CD34表达于粘连组织中血管新生内皮细胞的胞膜中～呈棕黄色～可反映新生血管发生程度(图2D、图2E)。第8天时～各组CD34蛋白表达量差别具有统计学意义(P<0.01,～A组最强～次之分别为H组、C组、S组～B组最弱(表2、图2F,。第15天时～各组CD34蛋白表达 量差别具有统计学意义(P<0.01,～A组最强～次之分别为H组、C组、B组、S组最弱。表1 实验大鼠腹腔粘连评分,略,表2 各组实验大鼠VEGF和CD34免疫组化阳性颗粒平均吸光度,略, 3 讨 论 腹腔粘连～实质为腹膜表面受损后瘢痕化形成的病理性组织。有关术后腹腔粘连发生机理～目前仍以炎症学说较为流行～即细菌感染、缺血、异物存留、机械性及化学性损害等造成腹膜及基底膜的损伤～导致炎性渗出～改变了纤维蛋白沉积和溶解间的平衡～使渗出物中纤维蛋白原和纤维蛋白析出～产生纤维蛋白性粘连,加之毛细血管新生旺盛～加剧腹膜、浆膜相互粘连。腹膜粘连有两种结局:一种是通过巨噬细胞的吞噬作用和内源性纤溶系统将纤维蛋白清除～由再生的间皮细胞覆盖创面达到生理性修复。另一种是无间皮细胞再生或覆盖～创面是非生理性修复～纤维蛋白粘连在形成12，24h后粘着于其他浆膜～随后成纤维细胞大量增生～并不断产生胶原纤维～于是初步粘连转变成牢固的纤维性粘连。在纤维性粘连中有微血管存在～这一过程约5，7d。然而目前针对以上病理环节的预防方法效果不尽人意。因此～有必要对术后腹腔粘连形成的机制做进一步的研究～并在此基础上寻找新的对抗粘连形成的靶点～以期更有效的防治措施。 环氧化酶包括环氧合酶,和环氧合酶,。炎症引起介导前列腺素释放和局部疼痛超敏反应～而与非炎症反应的前列腺素释放如血小板聚集等有关。近来发现了可选择性抑制而不影响活性的化合物～其在减轻炎症的同时可限制由抑制而导致的副作用～如胃肠道副反应～抑制血小板聚集造成的出血等。此外～选择性抑制剂在相当多的体外和体内实验中被证实能调节血管发生。 有研究表明血管发生在粘连形成中发挥重要作用～粘连形成类似于所有类型的创伤愈合～可能依赖于血管发生。SAED等发现来自粘连组织的成纤维细胞表达和酶～而来自非粘连区域的成纤维细胞则不表达,当缺氧刺激来自正常腹膜组织的成纤维细胞后～其酶表达量和其反应产物PGE2增加。这一结果提示 在粘连形成中可能扮演重要角色。在一系列肿瘤实验中～ 高表达可明显上调VEGF、bFGF和PDGF等促血管生成因子～而 VEGF、bFGF、均在粘连形成过程中表达上调。本实验发 现Celecoxib干预组动物损伤腹膜和粘连组织中VEGF水平明显降低～ 微血管密度显著下降～了选择性抑制剂抑制内皮所介导粘 连形成的可能机制。实验结果还显示Celecoxib预防粘连的效果好于 透明质酸钠凝胶。除其抑制新生血管发生之外～Celecoxib有抑制成纤 维细胞活性的作用[8]～使Celecoxib比其他抑制剂有更好的 防粘连效果。 术后腹腔粘连的形成是一个动态过程。粘连形成的高峰时期是术后3， 7d～而术后2周则形成稳定的纤维性粘连。为评估Celecoxib预防术 后腹腔粘连效果的持续性～实验对大鼠术后给药7d～而观察点则选取 术后第8天(停药当天,和术后第15天(停药后第7天,。结果显示～ 术后第15天动物的粘连程度类似于术后第8天～说明Celecoxib预防 术后腹腔粘连的效果是可靠的。 既往研究中抗粘连药物通常是腹腔内注射给药～临床适用性差。本实 验尝试应用临床常规剂量连续经口给药～模拟临床使用情况～具有不 良反应小～给药方便等优势。总之～选择性抑制剂 Celecoxib～在大鼠模型中可以提供持续的抗外科粘连形成的效果。 【参考文献】 DURON JJ, SILVA NJ, DU MONTCEL ST, et al. Adhesive postoperative small bowel obstruction: incidence and risk factors of recurrence after surgical treatment: a multi KATADA J, SAITO H, OHASHI A. Significance of kinase in mechanica in human peritoneal fibroblasts [J]. Fertil Steril, 2005, expressed in human fibroblasts isolated from intraperitoneal adhesions but not from normal peritoneal tissues [J]. Fertil WICZYK HP, GROW DR, ADAMS LA, et al. Pelvic adhesions contain sex steroid receptors and produce angiogenesis growth CHEGINI N. The role of growth factors in peritoneal beta) [J]. Eur 陈广理～龚树生～刘英鹏～等. 喉鳞状细胞癌组织中血管内皮生 长因子和环氧化酶检测 [J]. 郑州大学学报:医学版, 2007, [8]KUSUNOKI N, YAMAZAKI R, KAWAI S. Induction of apoptosis in rheumatoid synovial fibroblasts by celecoxib, but not by other selective cyclooxygenase 2 inhibitors [J].