人脐带间充质干细胞对小鼠自然衰老过程中骨髓脂肪化的影响

人脐带间充质干细胞对小鼠自然衰老过程中骨髓脂肪化的影响 ( ) [文章编号 ] 1000 - 4718 2010 04 - 0816 - 03 人脐带间充质干细胞对小鼠自然衰老过程中 3 骨髓脂肪化的影响 ?许婷婷 , 周艳华 , 李 军 , 谭广销 , 刘革修 () 暨南大学医学院血液病研究所 , 广东 广州 510632 ( )[摘 要 ] 目的 : 探讨人脐带间充质干细胞 hUC - M SC对小鼠自然衰老过程中骨髓脂肪化的延缓作用 。方 法 :从新生儿脐带分离间充质干细胞 , 不成年小鼠骨 髓 M SC 进行生 长 增 殖 不 成 骨 成 脂 分 化 比 较 。将 6 月 龄 的 5 ( ) BALB / c小鼠随机分为实验组和对照组 ,前者输注 hUC - M SC 5 ×10ce lls /mou se,每月 1 次 ,共 6 次 ; 后者输注生 γ理盐水 。干预后第 6个月观察幵比较 2组小鼠骨髓切片及 PPAR蛋白表达情况 。结果 : hUC - M SC增殖活性和成 骨分化能力明显强于成年小鼠骨髓 M SC,而成脂能力相对较弱 。骨髓切片显示实验组骨髓脂肪组织明显少于对照 γ组 , PPAR蛋白的表达量也较低 。结论 :脐带 M SC作为一种新来源的 M SC,能够抑制小鼠自然衰老进程中骨髓的 脂肪化 ,有望应用于抗衰老研究 。 [关键词 ] 人脐带间质干细胞 ; 脂细胞 ; 衰老 [ KEY W O RD S] H um an um b ilica l co rd m e senchym a l stem ce lls; A d ipocyte s; A ging do i: 10. 3969 / . j issn. 1000 - 4718. 2010. 04. 037 [中图分类号 ] R363 [文献标识码 ] A 人骨髓从婴儿出生直到年老 ,经历了红骨髓向黄骨髓的 2 方法 转发 。黄骨髓主要由脂肪组织构成 , 其造血功能甚微 , 而且 2. 1 间充质干细胞的分离培养不鉴定( ) 1 脐带 M SC 脐 大量的脂肪细胞会明显减慢骨髓中血细胞的形成速度 ,骨髓 带经 PB S液清洗 ,幵剪碎 ,经等体积 012%胶原酶 ?消化 4 h, 的脂肪化在骨质疏松症 、股骨头坏死等常见老年疾病中尤为 得到的混悬液过 200 目筛网 , 收集滤过液 , 用 PB S充分稀释 明显 , 这些发化将严重影响骨髓 造血 、进而影响 人体健 康 。 后 ,离心幵漂洗 , 得到悬浮细胞 , 计数接种于 含 10% FB S 的 ()骨髓间充质干细胞 m e senchym a l stem ce lls, M SC是位于骨髓 DM EM F12 完全培养液的培养瓶中 ,置于 37 ?、5% CO、饱和 2 腔内一种具有多向分化潜能 、造血支持和克疫调控功能的成 湿度培养箱中培养 , 3 d 后全量换液 ,弃去非贴壁细胞 ,约 5 d 体干细胞 ,可以向成骨和成脂分化 , 是骨髓脂肪细胞和成骨 戒细胞融合达 80 %时 ,用 0125 %胰酶消化 ,按 1 ?2 传代 。以 [ 1 ] 细胞的 来 源 。本 研 究 拟 采 用 新 生 儿 脐 带 间 充 质 干 细 胞 后每 2 d 完全换液 1次 ,约 4 d传代 1次 ,留第 2 - 4代细胞备 ( ) hum an um b ilica l co rd m e senchym a l stem ce lls, hUC - M SC 对 ( )用 。 2成年小鼠骨髓 M SC 按本实验室已建立的方法 进 小鼠自然衰老过程中骨髓脂肪化进行干预研究 ,观察其是否 行 ,叏 6月龄小鼠断颈处死后乙醇浸泡 ,叏出双侧股骨幵剪开 能抑制脂肪化 ,以期为延缓造血系统衰老的研究开辟一条新 2端 ,用含 10 % FB S的 DM EM F12 培养基从干骺端反复冲洗 思路 。骨髓腔 ,将冲洗下来的液体离心后重悬接种 。分别叏第 3 代 骨髓 M SC不 hUC - M SC,进行成骨成脂诱导分化 。M SC的鉴 材 料 和 方 法 定采用传代培养 、形 态 观 察 及 流 式 细 胞 仪 检 测 其 表 面 标 志 ( ) CD106、CD45、CD34、CD29、CD44、HLA - DR 及成骨成脂诱 1 材料 导分化实验 。 足月剖宫产健康新生儿的脐带叏自暨南大学华侨医院 , 2. 2 hUC - M SC不成年小鼠骨髓 M SC生长增殖不成骨成脂 产妇无传染性疾病 ,幵按 2005 年国务院《医院管理条例 》第 分化比较 分别叏第 3 代 hUC - M SC、成年小鼠骨髓 M SC 进 33条觃定对产妇的治疗及风险进行如实告知 ,产妇及其家属 μ行生长曲线测定 。成骨细胞诱导采用含有 011 mo l /L 地塞 对胎盘可能用于科学研究均签署知情同意书 ,实验经医 β μ米松 、10 mmo l /L- 磷酸甘油 、50mo l /L 抗坏血酸和含 10 % 院医学伦理委员会批准 。6 月龄 SPF级雌性 BALB / c纯系小 FB S的 DM EM F12 培养基 ,分别在诱导培养第 7 d 和第 14 d (鼠 40只 ,购 自 南 方 医 科 大 实 验 劢 物 中 心 劢 物 合 格 证 号 : 时 ,收集细胞 ,加入 PB S放入 - 20 ?冰箱反复冻融 3 次 ,采用 ) 0043640 。DM EM F12 培养基 、胶原酶 ?和胰蛋白酶均购自 以磷酸对硝基苯为底物的劢力学测定方法检测细胞碱性磷 Gibco。胎 牛 血 清 购 自 PAA。 PE 标 记 的 抗 CD34、CD45、 () μ酸酶活性 AL P。脂肪细胞诱导采用含有 1 mo l /L 地塞米 CD106及 F ITC标记的抗 CD44、CD29、CDHLA - DR 单兊隆抗 3 γ松 、5 ×10U /L 胰岛素和 5% FB S的 DM EM F12 培养基进行 , 体及小鼠相应的同型对照购自 B ec ton D ick in son。 PPAR克 疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术公司产品 。地塞 观察到胞质中有脂滴形成时 , 4 %多聚甲醛固定 、01375 %油 β 米松 、胰岛素 、抗坏血酸 、- 磷酸甘油不油红 O 购自 Sigm a。 红 O 染色检测 。 [收稿日期 ] 2009 - 09 - 01 [修回日期 ] 2009 - 11 - 24 ()3 [基金项目 ]国家自然科学基釐资劣项目 No. 30670902 ?通讯作者 Te l: 020 - 85220262; E - m a il: tliugx@ jnu. edu. cn 2. 3 hUC - M SC干预小鼠自然衰老过程中骨髓脂肪化的观 hUC - M SC生长曲线呈上升陡直的“S”形 , 接种后第 1、 察 6月龄雌性 BALB / c小鼠 40只 ,随机留叏 8只小鼠 ,用于 2 d为潜伏适应期 ,从第 3 d细胞开始增殖加速幵进入对数生 成年小鼠骨髓 M SC的成骨成脂分化研究 ,剩下的随机分为实 长期 ,第 5 - 6 d达到高峰 ,以后进入平台期 。成年小鼠骨髓 验组和对照组 ,每组各 16 只 。饲养于层流无菌环境 ,无菌饮 M SC 生长曲线呈上升迟缓的“S”形 ,细胞倍增速度慢 。M SC ( )食 、饮水 。 1 实验组为 M SC 干预组 : 经尾静脉输注第 2 代 经成脂诱导后 ,形态収生明显发化 ,由长梭形发成类囿形 、囿 5 ) (hUC - M SC 011 mL 含 5 ×10个细胞 ,每个月后重复输注 形细胞 ,胞浆内有很多脂滴形成 。油红 O 染色后 ,可以看到 2 ( )hUC - M SC 1次 ,共 6次 ; 2对照组为未干预组 : 相应经尾静 组 M SC s内均有红色脂滴 。不 hUC - M SC相比 ,骨髓 M SC 组 (脉输注 011 mL 生理盐水 。于第 6个月处死小鼠 ,得到的股骨 収生形态改发的细胞数量多 , 脂滴形成的时间早 第 6 d 出 )()快速放入 4%的盐酸甲醛脱钙固定液中 , 12 h 后进行常觃脱 现 且体积大 ,而 hUC - M SC组脂滴形成晚 第 11 d出现 且 水 、浸蜡 、石蜡包埋 、切片 , H E染色后在显微镜下观察骨髓造 呈碎点状分布 ,见图 1A、B。AL P 是 M SC 成骨分化后最早出 血组织情况幵摄像 。同时叏部分骨髓组织切片 ,采用克疫组 现的成骨性标志 , 2组 AL P 表达量发化见表 1,在成骨诱导后 γ(( ) 织化学染色检测 PPAR蛋白的表达 操作步骤按试剂盒说 第 7 d, 2组 AL P 表达量无明显差异 P > 0105 ; 在成骨诱导 ) 明进行 ,从分子水平了解骨髓成脂分化情况 。 后第 14 d, hUC - M SC 组 AL P 表达量明显增加 ,是骨髓 M SC ( ) 组的 213倍 P < 0101 ,差异显著 。这些结果说明 hUC - M SC 3 统计学处理 ( ) 数据以均数 ?差 xx ?s表示 ,采用 SPSS 1610 统计 属于原始年轻的 M SC,具有更强的生物学功能 。 软件 ,组间比较采用 t检验 。 表 1 成骨诱导后第 7 d、14 d 时各组细胞 AL P 表达量 ( ) Tab le 1. The exp re ssion leve l of AL P on 7 d, 14 d xx ?s. n = 8 结果 Group 7 d 14 d ??1 人脐带间充质干细胞的分离 、培养及免疫表型鉴定结果 hUC - M SC ?0. 014 0. 065 0. 183 ?0. 026 观察収现 ,采用上述方法从脐带组织中分离的细胞 , 一 0. 058 ?0. 011 0. 079 ?0. 015 Bone m a rrow M SC 部分于 12 h 内开始贴壁 , 3 d 内大部分细胞贴壁 , 细胞呈梭 ?? P < 0101 vs bone m a rrow M SC group. 形 、多角形 ,幵可见多个细胞形成集落 ,但仍有囿形细胞混杂 γ3 hUC - M SC 输注对小鼠骨髓病理变化及 PPA R蛋白表 其中 。4 - 5 d后传代 ,传代后的细胞主要呈长梭形 , 形态较 达的影响 原代均一 ,以平行排列生长为主 ,戒呈漩涡状生长 。第 3代细 实验组骨髓切片的造血组织明显多于对照组 ,有核细胞 胞经成骨成脂分化诱导 , 可分化为成骨细胞和脂肪细胞 ; 流 较多 ;而对照组骨髓切片的脂肪组织明显多于实验组 , 见图 式细胞术检测 ,人脐带 M SC 强表达 CD44、CD29,不表达造血 γ1C、D、E、F。 PPAR蛋白阳性表达为棕色 , 多定位于基质细 干细胞标志 CD34和 CD45,不表达 HLA - DR 和 CD106。 γ PPAR胞胞浆内 ,也有部分位于胞核内 ,实验组骨髓细胞中 2 hUC - M SC 与成年小鼠骨髓 M SC 生长增殖与成骨成脂 蛋白的阳性表达明显低于对照组 ,见图 1 G、H。分化的比较结果 F igu re 1. L igh t m ic ro scop y im age of ce lls. A: the d iffe ren tia tion of hUC - M SC to ad ipo se ce lls; B: the d iffe ren tia tion of bone m a rrow ( ) M SC to ad ipo se ce lls o il red O , ×200; C, D: c ro ss and longitud ina l sec tion of bone m a rrow in exp e rim en ta l group; E, ( ) F: c ro ss and longitud ina l sec tion of bone m a rrow in con tro l group H E, ×50 ; G: imm unoh istochem istry sta in ing fo r γ γ ( ) PPARof exp e rim en ta l group; H: imm unoh istochem istry sta in ing fo r PPARof con tro l group SP, ×200. 图 1 光学显微镜下的细胞形态 从上述分析中我们认为将具有更强生物学功能的 hUC - M SC定期输给逐渐老年的小鼠体内 ,不仅其自身可以进行 成骨分化 ,提供 H SC龛位 ; 还分泌许多细胞因子 , 如 : 神经生 长因子 、血管内皮生长因子 、干细胞生长因子 、F lt - 3 ligand、[ 6, 7 ] TPO、L IF、IL - 6和 IL - 11等 。这些细胞因子可以积极作 用于老年小鼠 H SC, 促进其增殖分化 , 而后者可能又反过来 支持促进自身的骨髓 M SC,形成互相促进的良性循环 ; 也可 能作用于小鼠自身的 骨髓 M SC, 上 调 其 成 骨 分 化 的 相 关 基 因 ,下调成脂分化基因的表达 ,抑制骨髓脂肪化 。 综上所述 ,本研究证实了 hUC - M SC 可以抑制小鼠自然 衰老进程中骨髓的脂肪化 , 为老年股骨头坏死 、骨质疏松症 F igu re 2. Grow th cu rve of hUC - M SC and bone m a rrow M SC. 等骨髓过度脂肪化疾病提供了新的思路 。但是调节 M SC 分 图 2 hUC - M SC 和成年小鼠骨髓 M SC 的生长曲线 化的分子机制很复杂 ,其抑制骨髓脂肪化的具体机制还不清 讨论 楚 ,仍需进一步的实验 。 本研究结果収现 , hUC - M SC属于较原始的 M SC,比中老 [参 考 文 献 ] 年小鼠骨髓 M SC具有更强的生物学功能 ,给中老年小鼠定期 [ 1 ] 刘 宁 ,杨淑野 ,王双利 ,等. 骨髓间充质干细胞不仿生 输注该细胞 ,其骨髓组织切片观察収现实验组造血组织比同 纳米壳聚糖 - 胶原复合物修复大鼠胫骨缺损的实验研 期对照组丰富 、脂肪化轻 ; 未经 hUC - M SC 干预的小鼠骨髓( ) 究 [ J ]. 中国病理生理杂志 , 2008 , 24 6 : 1161 - 1165. γ细胞 PPAR蛋白表达量明显高于 hUC - M SC 干预小鼠 。这 N u tta ll M E, Gim b le JM. Con tro lling the ba lance be tween [ 2 ] 些结果说明 hUC - M SC 干预可抑制小鼠自然衰老进程中骨 o steob la stogene sis and ad ipogene sis and the con sequen t 髓的脂肪化 ,可用于造血系统抗衰老研究 , 根据现有资料推 the rap eu tic imp lica tion s[ J ]. Cu rr Op in Pha rm aco l, 2004, 测其机制可能有多方面因素 。 ( ) 4 3 : 290 - 294. 骨髓 M SC是骨髓中成骨细胞和脂肪细胞的共同来源 ,在Khan E, A bu - Am e r Y. A c tiva tion of p e roxisom e p ro life r2 [ 3 ] β 个体正常収育过程中 ,这 2 种分化途径通过 TEG - 、BM P s、a to r - ac tiva ted recep to r - gamm a inh ib its d iffe ren tia tion of γ() PPAR2、生长激素 、1 , 25 OH D和雌激素等的调节而维持2 3 ( ) p reo steob la sts [ J ]. J L ab C lin M ed, 2003, 142 1: 29 - [ 2 ] 在平衡状态 。当机体年轻时 ,骨髓 M SC成骨相关基因表达 34. 活跃 ,分泌成骨刺激因子 ,促进成骨分化 ; 这些因子也可能抑 J a iswa l R K, J a iswa l N , B rude r SP, e t a l. A du lt hum an [ 4 ] 制 M SC成脂基因的表达 ,使得该平衡趋向于成骨细胞方向分 m e senchym a l stem ce ll d iffe ren tia tion to the o steogen ic o r 化 ,这不仅参不骨组织的构成 , 还是修复 H SC 壁龛的关键细 ad ipogen ic lineage is regu la ted by m itogen - ac tiva ted p ro2 ( 胞成分 ,同时年轻的 M SC可以分泌许多造血干细胞 hem a to2 ( ) te in k ina se [ J ]. J B io l Chem , 2000 , 275 13 : 9645 - )po ie tic stem ce ll, H SC相关生长因子 ,促进造血 。当机体逐渐 9652. 衰老时 ,骨髓 M SC数量不活性不断下降 ,成骨相关基因表达 王华松 ,陈庄洪 ,罗永湘. 髓内脂肪细胞促骨髓基质细 [ 5 ] 减少 ,相反地 ,不成脂相关的基因逐渐活跃幵表达 ,介导 M SC 胞凋亡的实验研究 [ J ]. 中国骨质疏松杂志 , 2005, 11 成脂分化过程中起关键性作用的转录因子过氧化物酶体增 ( ) 3: 325 - 328. [ 3 ][ 4 ] γ( γ) 殖物激活叐体 PPAR表达升高 ,使得该平衡转为成 朱光荣 ,周小玉 ,陆 化 ,等. 人骨髓间充质干细胞表达 [ 6 ] 脂分化占优势 , 导致骨髓中脂肪组织增多 。此时 , 首先成骨 多种造血细胞因子 [ J ]. 中国实验血液学杂志 , 2003, 11 叐到抑制 , H SC龛位减少 ,黏附分子也収生改发 ,进而抑制了 ( ) 2: 115 - 119. 造血干 /祖细胞的增殖和分化 ; 其次 ,骨髓内的脂肪细胞可诱 M a itra B , Szeke ly E, Gjin i K, e t a l. H um an m e senchym a l [ 7 ] [ 5 ] 导骨髓 M SC的凋亡 ;再则 ,骨髓中 H SC不 M SC是相互作用 stem ce lls suppo rt un re la ted dono r hem a topo ie tic stem ce lls 相互影响的细胞体系 ,当机体进入老年阶段时 , H SC 和 M SC and supp re ss T - ce ll ac tiva tion [ J ]. Bone M a rrow Tran s2 都会出现衰老 ,出现相互削弱对方作用的恶性循环 , 骨髓造 ( ) p lan t, 2004, 33 6: 597 - 604. 血被进一步抑制 。