【doc】 产肠毒素性大肠埃希氏菌基因工程疫苗的研究进展

【doc】 产肠毒素性大肠埃希氏菌基因工程疫苗的研究进展 产肠毒素性大肠埃希氏菌基因工程疫苗的 研究进展 中国兽医科技2005,35(11):923—927 ChineseJournalofVeterinaryScienceandFechnology 产肠毒素性大肠埃希氏茵基因工程疫苗的研究进展 卫广森,许崇波,孙宇. (1.中国农业科学院兰州兽医研究所,甘肃兰州730046;2.大连大学 生物工程学院,辽宁大连116000;3.辽阳市动物防疫站,辽宁辽阳111000) 摘要:简述了产肠毒性大肠埃希氏菌(ETEC)K88一K..,K88ac—LTB,K..一F41和ST—LT双价基因 工程疫苗的研制方法,生产工艺,免疫效果及生态效应及其研究进展,同时阐明了用这些疫苗免疫 妊娠母畜,可使吸吮了母畜初乳的幼畜的腹泻发病率和死亡率显着下降,且不会带来生态环境污 染.认为这些基因工程疫苗仍有不足之处,需要进一步加以改进. 关键词:产肠毒性大肠埃希氏菌;基因工程疫苗;腹泻;仔猪;羔羊 中图分类号:S852.612:Q7—101文献标识码:A文章编号:1000—6419(2005)11-0923—05 Advanceindevelopmentofengineeringvaccinesagainstenter0t0xigenic Escherichiacoli WEIGuang—sen.XUChong—bo,SUNYu (1.LanzhouVeterinaryResearehInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,China; 2.CollegeofB0Pg”PPr”g,DalianUniversity,Dalian116000,China;3.LiaoyangPrefecture AnimalQuarantineStation,Liaoyang111000,China) Abstract:Developmentmethods,productiontechnologies,immunologicalresultsandecological responseswerereviewedbrieflyonK88一K99,K88ac—LTB,K99一 F41andST—LTengineeringvaccinesagainsten— terotoxigenicEscherichiacoli(ETEC).Studiesshowedthatwhenthepregnantanimalswereimmunized withoneofthoseengineeringvaccines,themorbidityanddeathratesofdiarrheaintheiroffsprings,which hadsuckedtheirmother’Scolostricfluids,decreasedsignificantly.andtheengineeringvaccinesdon’t bringanyecologicalandenvironmentalpollutions.Theauthorsconsiderthatthoseengineeringvaccines havesomeshortcomingsandshouldbeimproved. Keywords:enterotoxigenicEscherichiacoli;engineeringvaccine;diarrhea;piglet;lamb 产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)是引起幼畜 腹泻的主要病原菌.ETEC具有两类致病因子:一 类为肠毒素,另一类为黏附素(或称定居因子),已知 的黏附素有K,K…F和987P等.ETEC借助这 些黏附素定居于宿主肠道黏膜的上皮细胞,从而大 量繁殖,产生大量肠毒素,由肠毒素造成肠黏膜上皮 细胞的病理性变化,导致幼畜腹泻.ETEC所致的 幼畜腹泻在我国流行十分广泛,发病率和死亡率都 很高,即便是病愈存活的幼畜,其生长发育和生产性 能也会受到严重影响,给畜牧业生产造成了极其严 重的经济损失.对由ETEC引起的腹泻,国内外长 期采取药物治疗方法,但由于耐药菌株的产生,药物 治疗效果一般不甚理想.研究,免疫预防是一 条非常有效的防止幼畜腹泻的途径.目前,国内外 对黏附素和肠毒素进行了基因工程疫苗的研究,均 取得了很好的成果. l大肠埃希氏茵K..一K,,双价基因工程疫苗 张景六等口将已构建的K抗原工程菌质粒 pTK90和K..抗原工程菌质粒pTK56-1用限制性 内切酶BamH工酶切,再用T4DNA连接酶连接, 转化至大肠埃希氏菌C600菌株中,筛选出携有质 粒pTK8899—1的T8899—1工程菌株.为了去除 pTK8899—1质粒上与K..基因无关的DNA序列,他 收稿日期:2005—08—11 作者简介:卫广森(1956一),男,辽宁西丰人,研究员,博士,Tel:0931—4960932,E-mail:weiguangsen@126.corn 924中国兽医科技第35卷 们将pTK8899—1DNA重新用BamHI酶切,构建 出带有质粒pTK8899—6或pTK8899—8的大肠埃希 氏菌C600,这种双价基因工程菌株可用于制备预防 仔猪黄痢的疫苗.在妊娠母猪产前第21d注射该 双价基因工程疫苗,母猪分娩后测定初乳中的Kss, K..抗体;结果,在初乳中存在K,K.高效价抗体, 仔猪吮吸初乳后,能够有效阻止ETEC的感染. 1985,1987年间.免疫母猪7555头,产仔猪80753 头,腹泻发病率为1.92,死亡率为0.35;对照组 母猪402头,产仔猪6001头,腹泻发病率为 24.98,死亡率为6.88.随后,顾大年等报道 了K.一K..双价基因工程菌的高密度发酵和抗原蛋 白疫苗的生产工艺.这样制备的疫苗不含菌体,不 需要甲醛处理,抗原蛋白保持了天然空间结构,有利 于诱导产生抗体;同时,这种冻干制剂可以长期保 存,便于贮藏和运输,解决了疫苗应用中的”冷链”问 题.陈章水等构建了K.一K..双价基因工程菌株, 该菌株具有同时产生K,K..2种表面抗原的能 力,其表达水平已达到或超过野生供体菌株.用该 菌株制备的疫苗免疫妊娠母猪后,可以产生良好的 免疫应答,血清中K..,K.2种抗体的效价为4o, 80倍,初乳抗体效价为8O,16O倍.仔猪通过吮吸 初乳获得K..,K2种保护性抗体后,在肠道黏膜产 生了局部免疫保护,阻止了产肠毒素性K..,K..菌 毛型大肠埃希氏菌的黏附定居,从而达到预防腹泻 的目的.该疫苗在全国接种免疫了近10万头妊娠 母猪,观察了近100万头仔猪的临床免疫效果,发病 率比对照组下降85以上,基本控制了仔猪黄痢的 发生.该菌在重组K..基因时,作为选择标记的 Amp抗性基因未去掉,当它与其他菌株接触时,有 可能将Amp抗性基因传递给无此抗性基因的菌 株,发生有害基因的扩散.为此,研究人员开展了 K..一K..工程菌株基因质粒在动物体内外扩散性的 试验研究.结果表明,采用皮下接种法,基本上排除 了细菌发生直接接触的机会,对防止有害基因扩散 无疑具有积极作用.细菌在猪体内的消长试验证 明,皮下接种该菌后,细菌被局限于接种部位,不会 扩散到血液.若由于使用不当,发生疫苗散落于体 外,进入消化道,则可能造成质粒的扩散.然而从猪 的模拟试验结果看,质粒的扩散现象并未得到证实. 由此说明,工程菌的应用不会成为新的污染源,对生 态环境不会产生人们所预想的不良影响. 2大肠埃希氏菌K88ac-LT双价基因工程 疫苗 李丰生等利用已克隆的含大肠埃希氏菌K.. ac抗原基因的pMM031质粒和含肠毒素IT抗原 基因的质粒pPMC4,使用限制性内切酶BamHI酶 切,取得Kac抗原基因片段,再与经BamHI酶切 的质粒pPMC4连接重组,构建了具有这2种抗原 基因的质粒pMM085.经琼脂糖凝胶电泳分析, pMM085质粒的分子质量为14.6Mu,在宿主菌 C600中,应用ELISA和反向间接血凝试验测定 K.ac抗原,结果都证明其抗原产量与亲本菌株基 本相同.对肠毒素抗原用被动溶血试验测定,结果 表明其LT的产量和亲本菌株的产量也基本相同. 重组的工程菌株MM一3没有毒性反应.因此,MM一 3可用来制备预防仔猪腹泻的活菌疫苗.陈添弥 等l_5报道,1985,1989年间,在我国南,北方60多 个猪场对不同品种进行MM一3疫苗免疫试验,免疫 妊娠母猪3437头,产仔猪33060头,腹泻发病率为 12.78,死亡率为1.26;对照组母猪1839头,产 仔猪17689头,腹泻发病率为63.36,死亡率为 13.79.腹泻发病率与死亡率在免疫后均大幅度 下降,与对照组差异极显着(P<0.01).但考虑到 遗传工程常用选择标记的抗性基因可能会形成生物 公害,不宜长期使用,黄培堂等以原来含LT亚单 位基因质粒DNA为载体,插入LacZ基因,构建了 一 个既能表达LT亚单位又能表达半乳糖苷酶的 含四环素抗性基因的重组体,随后在该重组DNA 的四环素抗性基因内再插入K..ac抗原基因,从而 灭活了四环素抗性基因,经测定该重组体(命名为 MM一6)能表达LTB和K88ac两种抗原,而且LacZ基 因取代了四环素抗性基因,成为良好的筛选标记. 与MM一3比较,MM一6同样具有良好的保护效果. 用MM一6免疫妊娠母猪135头,产仔猪1233头,腹 泻发病率为8.19,死亡率为3.81;对照组母猪 16头,产仔猪108头,腹泻发病率为47.22,死亡 率为42.59.后来,其他研究人员应用细菌质粒 转化技术,将大肠埃希氏菌IT和K..ac抗原基因 重组质粒转至猪霍乱沙门菌弱毒菌株中,转化的细 菌仍保持沙门菌的形态,生化及抗原特性,同时可稳 定地高效表达LT和K..ac两种抗原,表现出猪霍 乱沙门茵和产肠毒素性大肠埃希氏菌两种细菌的特 性,从而为这2种细菌双价基因工程疫苗的构建提 供了有效的候选菌株.应用已构建的仔猪副伤寒一 大肠埃希氏菌双价基因工程活疫苗,分别以口服和 肌肉注射两种途径免疫妊娠母猪,用间接BA— ELISA监测其血清及乳清中对猪霍乱沙门菌和大 肠埃希氏菌LTB,K..ac的IgG,IgM,IgA型抗体应 答.结果表明,在免疫母猪的血清及乳清中均可形 第ll期卫广森等:产肠毒素性大肠埃希氏菌基因工程疫苗的研究进 展925 成对这三种抗原较高水平的抗体反应. 3大肠埃希氏菌K,,一F|.双价基因工程疫苗 黄培堂等人用BamHI部分酶切表达K.抗 原的重组质粒pMGK99,并将其与相同酶切的含有 F抗原基因的片段连接,构建了载有2种抗原基因 的质粒pMG6ll.通过转化大肠埃希氏菌 HB101,RRI,C6O0,得到了HB101(pMG6l1),RRI (pMG611),C6OO(pMG6l1)菌株.试验证实,表达 的K.和F菌毛亚单位的分子质量与其各自的野 生菌株相同,分别是17.2ku和29.8ku.经ELISA 测定,HB101(pMG6l1)菌株(命名为MM一7)表达 K..和F菌毛抗原的水平高于其野生菌株.1990~ 1991年间,在内蒙古,河南进行了免疫试验,试验结 果,免疫妊娠母羊4927只,产羔羊9089只,腹泻发 病率为3.89,死亡率为0.73;对照组母羊2381 只,产羔羊2503只,腹泻发病率为33.95,死亡率 为12.6.结果表明,妊娠母羊经皮下注射MM一7, 能产生主动免疫,羔羊通过吮吸初乳可获得被动免 疫;MM一7具有很好的免疫原性一. 4大肠埃希氏菌ST-LT双价基因工程疫苗 由于ST的免疫原性极差,故难以制备有效的 疫苗用于防疫.为了增强ST的免疫原性,使其成 为一种强抗原,需将其连接到一个大的具有强抗原 性的蛋白质分子上.因此,ST和IT的融合研究首 先是在毒素蛋白质产物水平上进行的.Klipstein 等【Jo]用碳化二亚胺将ST和LT以100:1摩尔比 偶联起来,偶联产物的抗原性为原毒素的80%以 上,ST和IT毒性均为原毒素的0.15,在免疫小 鼠实验中,显示出良好的对ST和IT的保护作用. 随后Klipstein等将39ST和61LT化学偶联 的产物免疫小鼠,ST毒性为原毒素的0.060A.免 疫小鼠后血清IgG及黏膜IgA对肠毒素的抗体效 价增加4,7倍,并显示出ST和IT融合后均具有 各自的免疫原性.Frantz等?将合成的ST偶联 到载体蛋白上,加上弗氏佐剂免疫母猪和母牛,可以 产生抗体,抗体高峰可维持几周,可使新生动物免受 ETEC的攻击.因此,IT作为ST的载体蛋白,使 ST成为全抗原,可以引起免疫系统对ST和LT的 免疫应答. 基因融合后可以通过细菌培养源源不断地获得 融合蛋白,因而比化学交联又胜一筹.但作为研制 ETEC多价疫苗用的ST和LT融合研究仍在探索 中.已有的ITH与ST基因的融合研究表明,对于 将IT或ST放在N一端及c一端融合后的效果,尚无 本质的影响.Guzman-Verduzco等u将ST基因 的3末端与IT基因的5末端相连,产生的LT一 ST融合蛋白能够被抗LTH的抗体识别,但融合蛋 白仍然具有ST毒性.Sanchez等.在ITB-ST 基因融合研究中,观察到ST也可因霍乱毒素B亚 单位(CT—B)的载体蛋白作用而获得免疫原性,CT- B信号肽对整个融合基因产物的分泌起到了有效作 用.因此,这对于LTR与ST基因融合蛋白产物分 泌的研究无疑提供了有益的参考.Aitken等[1报 道,将编码ST前体蛋白(53肽,Prol9一ST)的基因 片段与LTn基因的3末端相融合,所产生的LT一 pre—ST.融合蛋白具有免疫原性,且降低了ST的肠 毒素活性.他们又将另一ST前体蛋白(23肽, Gly49一ST)的基因片段与LT基因的3末端相融 合,所产生的IT一pre—ST.融合蛋白具有免疫原性, 并引起免疫应答,但融合蛋白ST的肠毒素活性明 显高于前一种构建方式.这一结果暗示,Pro19与 Gly49之间的氨基酸具有减毒作用.他们认为出现 这一现象的原因可能是Pro19与Gly49之间的氨基 酸对ST和其受体之间的相互作用有竞争性或立体 性干扰.Cardenas等用基因融合的方法把ST 的结构基因片段(Ser54~Va172)连接在LTR全基因 的下游,并使之处于同一阅读框架中,构建出3种不 同的LTH—ST融合基因.经EIISA检测表明,该融 合基因能同时表达ST和LT两种肠毒素.当LT 基因和ST结构基因之间插入一段7个氨基酸 (Asp—Pro—Arg—Val—Pro-Ser-Ser)的多肽时,ST的表 达水平最高;当两者之间有3个氨基酸(Ile,Pro— Gly)时,ST表达次之;当两者之间不插入氨基酸 时,ELlSA没有检测到ST的存在.这种重组菌株 较好地解决了ST的免疫原性问题,并且使ST丧 失了毒性.张兆山等]采用与Cardenas等报道 的类似方法构建了LTe—ST融合基因.ELISA检 测表明,这些融合基因既能表达IT,也能表达ST. 当IT基因和ST结构基因之间插入21bp的寡核 苷酸时,ST的表达水平最高,比野生菌株E.coli H10407高8倍以上;当两者之问插入9bp的Lin— ker时,ST表达次之,是E.coliH10407菌株的3倍 左右;两者相隔33bp时,ST的表达水平与野生株 相近.Western—blotting试验显示了STl—LTH融合 蛋白的存在,但其表达产物仍具有ST毒性.上述 LT与ST的基因融合研究中,表达产物各部分活 性都受到不同程度的影响,尤其是ST活性下降更 为明显.另外,国内其他研究人员也进行了类似的 926中国兽医科技第35卷 研究,并取得了一定的结果. 许崇波等和卫广森等纠采用DNA重组 技术,利用初始质粒pEWD299(含有IT基因)和 克隆载体pUC18,构建了含有LTn基因的初级克隆 重组质粒pXLT1和次级克隆重组质粒pXLT1—1. 在此基础上,用BarnHI和Hind?双酶切pXIT1— 1,回收LT基因片段,定向克隆至已成功构建的另 一 重组质粒pXST1(含有经过突变的大肠埃希氏菌 耐热性肠毒素ST前体蛋白基因)中ST前体蛋白 基因的下游,构建了含有ST一IT融合基因的重组 质粒pXSIT1.最后用EcoR1和HindIII双酶切 pXSIT1,回收0.84kb的STIT融合基因,定向 克隆至表达载体pET一28b中的相应酶切位点上,构 建了含有ST.一LT融合基因的重组表达质粒pX— ETSIT1,并利用氯化钙转化法将其转化至受体菌 BL21(DE3)中,得到了重组菌株BI21(DE3)(pX— ETSIT1).其表达产物经SDS—PAGE和EIISA 检测,构建的重组菌株可以表达ST一LT融合蛋 白.经薄层凝胶扫描分析,表达量占菌体总蛋白相 对含量的33.21.以灭活的重组菌株BI21 (DE3)(pXETSLT1)的全菌体培养物,便成为预防 由ETEC引起的新生仔猪黄痢的双价基因工程疫 苗.他们认为,该菌株构建成功的主要原因在于以 下两点:?将2个ST基因连接在一起,增加了1个 抗原决定簇;?Cys转变成为Ser使得3对二硫键 中的1对消失,从而使得ST.的构象发生了改变,也 因此导致了ST生物毒性的丧失.用构建的基因工 程菌株研制的基因工程疫苗免疫实验动物和本动 物,均取得了良好的免疫效果. 5小结 预防幼畜ETEC腹泻用疫苗一直为畜牧业生 产所迫切需要,曾使用过的ETEC灭活疫苗的免疫 效果都不是十分理想,主要原因之一就是灭活疫苗 没有解决ST的免疫原性问题.自基因工程技术问 世以后,各国学者竞相应用该技术进行基因工程疫 苗的研制.从以上的研究结果也可以看到,研制出 的基因工程疫苗均取得了较好的免疫效果,但还不 十分理想,尚需进一步研制新型的ETEC基因工程 疫苗,才能在预防幼畜ETEC腹泻方面发挥更好的 作用. 参考文献(References) [1]张景六,蔡瑞珠,洪孟民.带K和K.两种菌毛抗原基 因的重组质粒的构建EJ].生物工程,1985,1(2): 34—4O. 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