杂色鲍野生群体与养殖群体自交和杂交子一代的RAPD分析

杂色鲍野生群体与养殖群体自交和杂交子一代的RAPD 杂色鲍野生群体与养殖群体自交和杂交子 一代的RAPD分析 第28卷 2O07 第4期 年8月 海洋水产研究 MARINEFISHERIESRESEARCH VoI.28,NO.4 Aug.,2007 杂色鲍野生群体与养殖群体自交和杂交子 石耀华王 一 代的RAPD分析 嫣曲艳波叶翠顾志峰王爱民 (海南大学海洋学院教育部热带生物资源重点实验室海南省热带水生生物技术重点实验室,海口570228) 摘要杂色鲍野生群体和养殖群体分别自交和杂交产生野生鲍自繁F1代(ww),养殖鲍自繁子代 (c),正交子一代(W旱×C含,简称WC)和反交子一代(C旱×W含,简称CW)4个群体,采用 RAPD分析4个群体遗传特性.就多态位点比例,Nei基因多样性值和Shannon信息指数而言,ww 群体比CC群体高;杂交群体wC的值分别为88.76,0.3246和0.4811,比其余群体都要高,与群 体ww最接近;另一杂交子代群体cw除多态位点比例比群体CC高外,其余参数均为最低.群体 间的遗传距离分析明,ww与各群体的遗传距离都较大,其中与CC群体的遗传 距离最大,为 0.0849,与两个杂交群体间的遗传距离分别为0.0772(CW)和0.0671(WC);CC群体 与两个杂交 群体间的遗传距离都较小,分别为0.06l0(与CW)和0.0597(与wC);杂交子代间的 遗传距离为 0.0600;杂交群体wC与ww的遗传距离大于与CC的遗传距离,Cw与ww的遗传 距离也大于与 CC间的遗传距离,两个杂交群体与亲本的遗传距离不对等,偏向养殖亲本. 关键词杂色鲍野生群体与养殖群体自交杂交子一代RAPD 中图分类号S968文献识别码A文章编号1000—7075(2007)04—0047—07 RAPDanalysisonthefirstgenerationfrominbreedingandcrossesof wildandculturedabalone,Haliotis,coZo,Reeve SHIYao-hua?NGYanQuYan-boYEHuiGUZhi-feng?NGAi—min (OceanCollege,HainanUniversity,KeyLaboratoryofTropicBiologicalResourcesofMinistryofEducation. HainanKeyLaboratoryofTropicalHydrobiologyTechnology,Haikou570228) ABSTRACTGeneticdifferencesofthefirstgenerationfrominbreedingandcrossesofwild andculturedabalone,HaliotisdiversicolorReevewereanalyzedwiththerandomamplified polymorphicDNA(RAPD)technique.Thefourpopulationsincludedww(wild旱×wild), CC(cultured早×cultured),thedirectcrossingpopulationCW(cultured旱×wild)and thereversecrossingpopulationWC(wild旱×cultured).Theratioofpolymorphicloci, Nei'SgenediversityandShannon'SInformationindexofWCwere88.769/6,0.3246and0.4811, respectively,allofthevaluesbeingthehighestamongthefourpopulations.Besides,thethree indexesofWWwerehigherthanthoseofCC.InanothercrossingpopulationCW.alltheinde— xeswerethelowestexceptthattheratioofpolymorphiclociwashigherthanthatofCC.Analy一 国家自然科学基金项目(30511140294)和海南省自然科学基金项目(80412)共同资 助 *通讯作者.E—mail:aimwang6@hotmail.tom,Tel:(0898)66187928 收稿日期:2006—02—13;接受日期:2006—05—08 作者简介:石耀华(1970一),男,博士,副教授,主要从事水产生物遗传育种,发育和养 殖研究.E-mail:stone70@sina.tom,Tel:(0898)66261349 48海洋水产研究第28卷 sisofgeneticdistanceshowedthatthehighestgeneticdistance(0.0849)appearedbetweenWW andCC.Thegeneticdistancewas0.0772betweenWWandCW,and0.0671betweenWW andWC.ThegeneticdistancesbetweenCCandbothcrossingpopulationswererelativelylow, viz.0.0610(betweenCCandCW)and0.0597(betweenCCandWC).Thegeneticdistance betweenthetWOcrossingpopulationswas0.0600.Theresultsshowedthatthegeneticdis— tancesbetweenCCandanyoneofthetWOcrossingpopulationswerehigherthanthosebetween WWandanyoneofthetWOcrossingpopulations.indicatingthatthegeneticdistanceswerenot equalbetweenthehybridsandthetWOparents,butmoresimilartoculturedpopulation. KEYWORDSHaliotisdiversicolorWildpopulationsandculturedpopulations InbreedingCrossingFirstgenerationsRAPD Melchinger(1990)认为在亲缘关系远的组合中,遗传距离与杂种优势无相关性,但 在遗传距离小于0.54 的范围内,杂交亲本间的遗传距离越大,子代基因组的杂合度越高,后代的杂种优 势越强.在鲍的杂交中,日本 盘鲍(HaliotisdiscusdiscusIno)和皱纹盘鲍((H.discushannaiIno)表现出杂种优势的 杂交后代比亲本的遗 传一致性程度低(Zr俊芬等2001),正反杂交子代在受精率,日生长,剥离后的存活 率等方面确实存在杂种优 势(燕敬平等1999).杂交组在幼体附着率,幼体变态率,幼体存活率以及稚贝早期生长方面,与自繁组相比 表现出不同程度的杂种优势.在鲍的不同地理种群杂交方面,张国范等(2002)用皱纹盘鲍中国群体与日本群 体建立了杂交和自交子一代家系,同时应用RAPD开展了遗传结构分析,表明杂交组合的杂合度均高于自交 组合,预测不同地理群体杂交能够获得杂种优势. 目前我国南方养殖杂色鲍(H.diversicolorReeve1846;又称九孔鲍)鲍苗脱板死亡严重,已导致苗种供 应严重不足,给南方的鲍养殖业造成了重大损失,但真正的原因尚未完全确定(徐力文等2004;王江勇等 2005).遗传改良技术可能是解决南方鲍养殖业困境的有效途径之一.游伟伟等(2005)开展了日本群体和台 湾群体的杂交,杂交组在幼体附着率,幼体变态率,幼体存活率以及稚贝早期生长方面表现出不同程度的杂种 优势.能否通过杂色鲍野生群体与养殖群体间杂交获得杂种优势和提高杂交子一代的抗逆性是本研究的主要 目的,特别是应用常见的RAPD(随机扩增多态性DNA,randomlyamplifiedpolymorphicDNA)标记技术对杂 色鲍野生群体与养殖群体自交和正反杂交子一代的分子遗传结构进行研究,探讨不同群体繁育后代的遗传多 样性以及正反交后代与亲本间的关系,从分子水平预测杂种优势,为杂色鲍育种和苗种生产实践提供分子遗传 学基础,为杂色鲍的种质资源的利用提供基础资料和科学依据. 1材料和 1.1材料 研究所用的人工养殖杂色鲍(C)自繁后代(简称CC),野生鲍(w)自繁子一代(简称ww),正交子一代(C 旱×W,简称CW),反交子一代(w旱xC,简称WC)的繁殖和培养均在海南三亚红塘名优水产养殖公司 进行.4个群体取材样本数分别为50,50,50和26个.取新鲜的足部肌肉,70乙醇固定2h,换用95%乙醇 固定,2,4h后再换1次95乙醇,于一20?保存备用. 1.2实验方法 1.2.1基因组DNA的提取 每个样品称取0.2g足部肌肉,0.8生理盐水漂洗,剪成细末,置于1.5ml离心管中,加入0.5mlSTE ElOmmol/LTris?HC1,pH8.0,1mmol/IEDTA(pH8.0),100mmol/LNaC1],65肚110的SDS和 61蛋白酶K(10mg/m1),颠倒混匀,55?保温消化4,6h,消化过程中每30min颠倒混匀1次.待肌肉消 第4期石耀华等:杂色鲍野生群体与养殖群体自交和杂交子一代的RAPD分析49 化完全后依次以等体积酚/氯仿(酚:氯仿:异戊醇一25:24:1)和氯仿/异戊醇(氯仿:异戊醇一24:1)各抽 提两次,然后加入两倍体积的无水乙醇室温沉淀DNA30min以上,7O%的乙醇洗涤沉淀两次,DNA沉淀于室 温干燥15rain后溶于250l灭菌双蒸水,取1l进行琼脂糖凝胶电泳,检测DNA的质量和估计浓度,其余 DNA置一2O?储藏备用. 1.2.2RAPD琏 PCR主要参照Williams等(1990),对各参数适当调整优化.扩增反应总体积15,25l.其中包括1×扩 增缓冲液(10mmol/LTris?HC1,pH8.3;50mmol/LKC1,0.001明胶),200/~mol/L的dNTPs,RAPD引 物0.2"mol/L,MgC120mmol/L,1UTaqDNA聚合酶,15,200ng基因组DNA.扩增参数为:94?预变 性4min;94?30S,36?30S,72?1min30S,45个循环;72?延伸5min. 1.2.3电泳观察 扩增产物用1.5琼脂糖凝胶电泳分离(1xTBE,3V/cm恒压),EB染色,凝胶成像系统观察和拍照. 1.2.4数据分析 统计各个样品的扩增带,转换为0(无带),1(有带)数据,将(0,1)矩列数据输入计算机,用PopGen32生物 软件进行处理.将RAPD标记作为等位基因,计算各种群的多态位点比例P,种群内的遗传多样性值和种群 间的遗传距离等.P一多态性扩增片段数扩增片段总数;种群内的遗传多样性值D一1一Sxy,遗传相似性指 数s.y一2Nxy/(N十N.y),相对遗传距离D.y一一ln(Sxy/Sx?Sy),其中Nxy是个体37和个体.y共有位点 数,Nx和Ny分别是个体和个体共扩增出位点数.群体内的相似性指数为此群体内所有个体间相似性指 数的平均值,群体间的相似性指数为两群体任意两个体的相似性指数的平均数.Sxy为两群体间的相似性指 数,,S.y分别表示群体X和群体y的相似性指数(Nei1972,1973).Shannon信息指数(Shannon'SInfor— mationindex)按照公式H一一:lna-//N计算,其中,7c为某一条带在群体中出现的频率,In为自然对数,N 为群体总的位点数(Wachiraeta1.1995). 遗传分化指数(Gst):群体总的基因多样性(Ht)分解为群体内基因多样性(Hs)和群体间基因多样性 (Ds):Ht=Hs十D,Gst=D/Ht.Hs一1一J一1一(?J)/s,S为群体的数目,J一(?x)/,J是 第i个群体内的基因一致性,x是第i个群体内第是个等位基因的频率,是i个群体的基因位点数目. D一(??D)/s.,D一(4-J)/2一 其中,J为第i个和第个群体间的基因一致性:J一(x*x)/n. 2结果 2.1RAPD扩增的图谱结果 对购自于大不列颠哥伦比亚大学(TheUniversityofBritishColumbia)的RAPDset#1的100条引物和 购自博亚生物技术有限公司(上海)的编号为BA0001-BA0200的200条RAPD引物进行了筛选,获得了16条 能够在各个群体中都能够扩增清晰出带纹的的随机引物(表1). 所选择的16条引物均能扩增出清晰可重复的扩增带(图1),每个个体片段数在1,9条之间.16条引物 扩增出的用于统计分析的扩增带共89条,扩增带大小位于0.4,2.5kb. 2.2群体内的多态位点比例和相似性指数 各群体的多态位点比例,Nei基因多样性值和Shannon信息指数等见表2.4个群体的多态位点比例均较 高,其中最小的养殖群体子代也有78.65;群体内的遗传多样性指数均高于0.28,表明群体内存在一定的遗 传变异.野生群体子代ww的多态位点比例,Nei基因多样性值和Shannon信息指数均比养殖群体子代CC 高;杂交群体CW除了多态位点比例较群体CC高外,其余两项指数值均为最低;另以野生鲍为母本以养殖鲍 为父本的反交群体WC的多态位点比例,Nei基因多样性值和Shannon信息指数分别为88.76,0.3246和 50海洋水产研究第28卷 0.4811,比其他各群体都要高,与野生群体子代ww最接近. 表1RAPD扩增的随机引物序列 TablelSequencesofRAPDprimer WW MM CW (M—DNA分子量标 记,X/EcoRI+HindIIIDNAMarker)(MDNAMarker,X/EcoRI+HindIIIDNAMarker) 图1NAPS96号RAPD引物扩增4个杂色鲍群体的琼脂糖凝胶电泳 Fig.1ElectrophoresismapofRAPDproductsamplifiedfrom4populations ofHaliotisdiversicolorDNAwithNASP96primer 2.3群体间的遗传距离 群体间的遗传距离分析表明(表3),野生群体子代ww与各群体的遗传距离都较大,其中与养殖群体子 代CC的遗传距离最大,为0.0849;与两个杂交群体间的遗传距离分别为0.0772(Cw)和0.067l(wC).养 殖群体子代CC与两个杂交群体间的遗传距离都较小,分别为0.0610(CW)和0.0597(wC);杂交子代间的遗 传距离为0.0600;杂交群体WC与ww的遗传距离小于与CC的遗传距离,CW与CC的遗传距离略小于与 ww间的遗传距离,两个杂交群体与亲本的遗传距离不对等,略偏向养殖亲本. 第4期石耀华等:杂色鲍野生群体与养殖群体自交和杂交子一代的RAPD分析51 表3鲍4个群体间的遗传相似性和遗传距离 Table3Nei'Sgeneticidentity(abovediagona1)andgeneticdistance(belowdiagona1) among4populationsofHaliotisdiversicolor 注:对角线以上为种群间遗传相似性,对角线以下为种群间遗传距离 群体相互间的遗传距离指数用"PHYLIP"软件包(PhylogenyInferencePackage,version3.5)的程序 Neighbor—Joining进行聚类分析,构建4个群体的聚类分支图(图2).CW群体与CC群体聚为一支,表明它们 间的相似性程度较高;这两个群体进而与群体WC聚在一起,表明这3个群体较为相似,与野生鲍子代群体 WW的差异较大. O.O1 0.041 CC ,W 图2根据遗传距离用Neighbor—Joining聚类分析构建的鲍4个群体的分支(重复运行1000次) Fig.2Phylogenetictreeinferredfromgeneticdistanceof4populationsofHaliotisdiversicolo rsupertextabyusing NeighborJoiningmethodwithKimura2-parameterdistance(derivedfrom1000replications ) 2.4总群体的基因多样性及基因分化系数 4个群体总的基因多样性(Ht)为0.3380,其中群体内的基因多样性(Hs)为0.3035,群体间的基因多样 性(Ds-r)为0.0345,基因分化系数为10.22. 3讨论 3.1野生杂色鲍子一代群体和养殖杂色鲍子一代群体的遗传多样性比较 RAPD技术是由Welsh等(1990)和Williams等(1990)分别领导的两个研究小组几乎同时发展起来的分 52海洋水产研究第28卷 子生物学技术,无需针对物种特异引物,反应灵敏度高,产物遗传多样性丰富,操作简便等优点,广泛地应 用于动植物研究中(周延清2005).近年来,RAPD在水产养殖生物的种群遗传学,遗传图谱,种质鉴定和分 子辅助育种等研究中的应用广泛(Iiufa1.2004).利用该技术对野生杂色鲍子一代群体ww和养殖杂色 鲍子代群体CC的遗传结构进行了比较分析.两个群体共检测出89个位点,群体ww和CC分别检测出78 和70个多态位点,多态位点比例分别为87.64和78.65,表明RAPD对杂色鲍具有较高的遗传多样性检 出率.杂色鲍养殖群体子代的多态位点比例与皱纹盘鲍养殖群体的研究结果 (72.37%)相似(张国范等 2002),野生子代的多态位点比例显着高于养殖子代.分析结果还表明,野生群体ww的Nei基因多样性值和 Shannon信息指数都比养殖群体CC高,而且,群体CC的Nei基因多样性值和Shannon信息指数也不是非常 低,分别为0.2958和0.4351,与多态位点比例结果相一致.黎中宝等(2004)用同工酶比较养殖九孔鲍(杂色 鲍)与野生杂色鲍时发现养殖群体的多态位点低于野生群体.养殖降低贝类遗传多样性的现象已受到普遍的 关注(王爱民等2000李成华等2004;宋林生等2002;ZhangPal.2005).尽管在作者的研究结果中 野生群体杂色鲍的遗传多样性高于养殖群体,养殖群体仍然具有较丰富的遗传多样性,目前还可以用于繁殖育 苗;但由于养殖群体的基因纯合程度较野生子代群体高,表明通过长期的养殖,养殖群体的遗传多样性表现出 逐代降低的趋势.因此,在进行杂色鲍育苗时,要注意亲本的选择,一方面不宜长期利用单一群体养殖鲍作为 育苗亲本,要增加不同群体,特别是不同地区养殖场间亲本的交换和杂交;另一方面要增加用作繁殖亲本的数 量.这两种措施结合起来将会有效地防止养殖所造成的遗传多样性急剧降低和近交衰退. 3.2野生杂色鲍与养殖杂色鲍不同杂交方式对子代遗传结构的影响 以养殖杂色鲍为母本,以野生杂色鲍为父本的正交子代群体CW除了多态位点比例较群体CC高外,Nei 基因多样性值和Shannon信息指数均为最低;而以野生鲍为母本以养殖鲍为父本的反交子代群体WC的多态 位点比例,Nei基因多样性值和Shannon信息指数分别为88.76%,0.3246和0.4811,比其他各群体都要高, 正交和反交表现出两种几乎完全不同的结果.反交子代的遗传多样性不仅比正交 子代高,而且表现出超亲现 象. 皱纹盘鲍和日本盘鲍正反杂交子代的相对遗传距离研究表明,杂交子代与两亲本的遗传距离不是对等的, 而是更偏向日本盘鲍(万俊芬等200]),即杂交子代并非同时偏向父本或母本,而是偏向其中的一个固定群 体.本研究中群体间遗传距离的分析结果与此相似,正交子代CW与养殖子代CC的遗传距离(0.0610)显着 小于其与野生杂色鲍子代ww的遗传距离(0.0772),反交子代WC与养殖子代CC的遗传距离(0.0597)也 显着小于其与野生杂色鲍子代ww的遗传距离(0.0671),杂交群体WC与ww的遗传距离大于与群体CC 的遗传距离,CW与CC的遗传距离也大于与ww间的遗传距离,两个杂交群体与亲本的遗传距离不对等,偏 向养殖群体.根据遗传距离用Neighbor,Joining聚类分析构建的鲍4个群体的分支图显示,CC和CW聚在一 起,二者进而和WC聚在一起,而ww形成单独的一支,说明野生杂色鲍子代与其他3个杂色鲍群体的遗传关 系较远,CC和CW问遗传关系最近.与此不同的是,张国范等(2002)对皱纹盘鲍中国群体和日本群体自交与 杂交的RAPD分析表明,各家系子代群体与父母亲本的遗传距离分析表明,皱纹盘鲍的子代倾向于父本基因 型的几率稍大,雄性遗传占主导地位.导致这种分析结果存在差异原因可能是多方面的:(1)物种间的差异, (2)养殖群体的遗传主导性,(3)使用引物的不同.要揭示其中的原因,需要进一步采用其他分子标记技术对不 同种类和不同群体的鲍进行研究分析. 4个群体总的基因多样性(Ht)为0.3380,其中群体内的基因多样性(Hs)为0.3035,表明群体内的遗传 变异水平较高;群体间的基因多样性(Dst)为0.0345,基因分化系数为10.22,也表现出较大的遗传差异. 野生杂色鲍与养殖杂色鲍正反杂交子代表现出的遗传多样性差异提示,在杂色鲍育苗时应注意选择亲本 的性别.杂交子代遗传多样性的超亲现象表明,通过野生与养殖杂色鲍的杂交能够提高子代的遗传多样性,克 服养殖群体长期自交造成的遗传衰退.杂交后代与养殖群体子代较与野生鲍子代的遗传距离小,即杂交后代 与养殖群体子代的遗传关系较近,可能暗示杂交子代具有较好的人工养殖适应性.因此,在进行杂色鲍育苗 时,选择合适的野生鲍和养殖鲍作为亲本进行杂交繁育,以期提高鲍苗的质量是可行的. 第4期石耀华等:杂色鲍野生群体与养殖群体自交和杂交子一代的RAPD分析53 万俊芬 报,3 王江勇 王爱民 参考文献 汪小龙,潘洁,李冰,李祯,包振民,燕敬平,方建光.2001.日本盘鲍×皱纹盘鲍子代杂种优势的RAPD分析.青岛海洋大学学 (4):506,512 王瑞旋,刘广锋,陈毕生,潘金培,徐华森.2005.杂色鲍幼苗大规模死亡与细菌数量的关系.南方水产,1(1):57,61 邓凤娇,张锡元,阎冰,叶力,毛勇,张木先.2000.马氏珠母贝遗传多样性的RAPD分析.武汉大学(自然科学版),46:467 , 470 宋林生,李俊强,李红蕾,崔朝霞,李成华,胥炜,常亚青.2002.用RAPD技术对我国栉 L扇贝野生种群与养殖群体的遗传结构及其遗传分 化的研究.高技术通讯,7;82,86 张国范,王继红,赵洪恩,阙华勇,刘晓.2002.皱纹盘鲍中国群体和日本群体的自交与杂交F1的RAPD标记.海洋与湖沼,33(5):484, 49l 李成华 周延清 徐力文 游伟伟 燕敬平 黎中宝 李太武,宋林生,苏秀榕.2004.4个缢蛏群体遗传结构的RAPD分析.水产科学,23(12):26,28 2005.DNA分子标记技术在植物研究中的应用.北京:化工工业出版社,79,l3O 刘广锋 柯才焕 孙慧玲 田柱 王江勇,王瑞旋,陈毕生.2004.杂色鲍育苗中"掉板症"的药物防治研究.海洋水产研究,25(4):41,45 蔡明夷,王志勇,王艺磊.2005.杂色鲍日本群体与台湾群体杂交的初步研究.厦门大学(自然科学版),44(5):701,705 方建光,张谢令,陈家彦,张春利.1999.日本盘鲍与皱纹盘鲍杂交育种技术研究.海洋水产研究,20(1):35,39 朱冬蕊,叶承义.2004.九L鲍和杂色鲍等位酶的生化遗传分析.海洋科学,28(2);27,31 Iiu,Z.J.,andCordes,J.F.2004.DNAmarkertechnologiesandtheirapplicationsinaquacultur egenetics.Aquaculture,238:1,37 Melchinger,A.E.,andLee,M.1990.Geneticdiversityforrestrictionfragmentlengthpolymo rphisms:Relationtoestimatedgeneticeffectsinmaize inbreeds.CropScience,30:1033,1040 Nei,M,1972,Geneticdistancebetweenpopulations.Am,Nat,106:283,292 Nei,M,1973,Analysisofgenediversityinsubdividedpopulations,Proc,Nat,Acad.Sci,USA,70:3321——3323 Wachira,F.N,,Waugh,R,,Hackett,C,,andPowell,W,l995.Detectionofgeneticdiversityintea(Camelliasinesis)usingRAPDmarkers.Ge home,38:201,210 Welsh,J,,andMcclelland,M,l990.FjngerprintinggenomeusingPCRwitharbitraryprimers,Nucleic.Acids.Res,l8:7213,7218 Williams,J,G,K,,Kubelik,A.R.,Livak,K,J,eta1.1990.DNApolymorphismsamplifiedbyarbitraryprimersareusefulasgeneticmarkers. 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