大鼠脊髓前角神经元内维生素D依赖性钙结合蛋白与小.doc

大鼠脊髓前角神经元内维生素D依赖性钙结合蛋白与小.doc 大鼠脊髓前角神经元内维生素D依赖性钙 结合蛋白与小 【关键词】 维生素D依赖性 【Abstract】 AIM: To observe the coexistence of calbindinD28k (CB) in (PV) in neurons of the anterior horn of the spinal cord in rats. METHODS: Immunofluorescence histochemical doublestaining method e of the medium and smallsized neurons in the anterior horn of the spinal cord shomunopositive staining. The majority of the CBimmunoreactive neurons also exhibited PVimmunoreactivities, i.e. CB and PV coexisted in these neurons. CONCLUSION: CB and PV coexist in some of the neurons in the anterior horn. CB/PV doublelabeled neurons might belong to Renshaay have some feedback inhibitory regulatory effects on the activities of α motor neurons in the anterior horn. 【Keybinding prtein, vitamin Ddependent; parvalbumins; Renshain, PV)是最常见的和功能比较明确的两种钙结合蛋白(calciumbinding proteins, CaBPs)，它们与细胞内Ca2+的存储和释放密切相关，并 能调节神经递质的释放和影响代谢,5,6,. Renshag/kg)腹腔麻醉后 开胸，经左心室插管至升主动脉，先用0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液 (PBS, pH 7.3)100 mL冲净血液，然后用500 mL含40 g/L多聚甲 醛、0.5 g/L戊二醛和2.5 g/L苦味酸的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB, pH 7.3)灌注固定1 h. 灌毕取出脊髓，置入上述新鲜固定液中后固 定4 h(4?)，再移入含300 g/L蔗糖的PB中过夜. 将脊髓冠状冰 冻切片，片厚20 μm，切片分为4组. 分别收集于0.01 mol/L的 PBS(pH 7.3)中. 将第1组切片裱于经明胶处理的载玻片上，5 g/L 的中性红染色，以便对照观察. 1.2.2免疫荧光组化染色CB和PV的免疫荧光组化双重染色: 将第2, 3组切片在常温下进行CB和PV的免疫荧光组化双重染色. 步骤如下: ? 分别用兔抗PV血清(1?8000, Sigma)/小鼠抗CB 血清(1?5000, Sigma)孵育24 h，孵育液为含3 g/L Triton X100和 25 g/L正常驴血清的PBS (PBSNDS); ? Biotin结合的驴抗兔 IgG (1?200, Chemicon)孵育3 h;? 100 g/L正常兔血清孵育30 min; ? 5 g/L Avidin结合的Texas Red (Vector)和5 g/L DTAF标 记的驴抗小鼠IgG (Chemicon)孵育3 h. 将切片裱于经明胶处理 的载玻片上避光干燥，用含500 g/L甘油的PBS封片. 用荧光显微 镜(BX60; Olympus)在不同的滤镜下观察Texas Red(激发波长 530,580 nm，发射波长?610 nm)和DTAF(激发波长450,490 nm，发射波长515,565 nm)标记的阳性结构. 1.2.3对照实验用正常兔和小鼠血清的混合液代替一抗孵育第4 组切片，其余染色过程同上，结果均为阴性. 2结果 在脊髓不同节段的前角，分别可见呈CB或PV阳性的神经元胞 体，尤其在颈膨大和腰膨大处最为明显. CB和PV阳性神经元胞体 主要位于脊髓前角内、外侧运动神经元柱(?层)之间的?层，CB 阳性神经元的数量略多于PV阳性神经元. CB和PV阳性神经元的胞 体多为圆形、梭形或三角形，最大直径多在10,25 μm之间. CB 和PV阳性纤维及终末也比较密集地分布于脊髓前角各节段(Fig 1A, B, C, D). 绝大多数CB阳性神经元亦呈PV阳性;CB/PV双标神经 元的数量较多，它们主要分布于脊髓全长的?层(Fig 1A, B, C, D). 计数结果表明CB/PV双标神经元的数量分别占CB和PV阳性神经 元数量的92.6%和95.3%. 3讨论 脊髓前角的灰质中，除了位于?层支配梭外肌和梭内肌的α运 动神经元和γ运动神经元以外，?层内还存在许多形态多样、性质 和种类不同的中间神经元，其中的部分小型中间神经元属于轴突短 且具抑制效应的Renshaw细胞. Renshaw细胞接受α运动神经元返回 轴突侧支的支配，而Renshaw细胞的轴突也与α运动神经元形成抑 制性突触联系，借此反馈调控α运动神经元的活动，保持运动的稳 定和准确,7,8,. 电生理学实验研究证实脊髓前角内的CB阳性神经元多为中间 神经元，大部分CB阳性神经元为Renshaw细胞并含有抑制性神经 递质GABA,4,. 还有研究观察到大多数运动神经元表面的CB阳 性终末于Renshaotoneurons innervating the soleus muscle in mice, rats, and cats ,J,. Neurochem Res, 2001;26(12):1301-1304. ,3, J, Matise MP. Topographical and physiological characterization of interneurons that express engrailed1 in the embryonic chick spinal cord ,J,. J Neurophysiol, 2000;84:2651-2657. ,4, Sapir T, Geimman ET, il Med Univ, 2001; 22(3):259-261. ,7, Dourado M, Sargent PB. Properties of nicotinic receptors under lying Renshaotor neurons in neonatal rat spinal cord ,J,. J Neurophysiol, 2002; 87(6):3117-3125. ,8, Carr PA, Liu M, Zaruba RA. Enzyme histochemical profile of immunohistochemically identified Renshabar spinal cord ,J,. Brain Res Bull, 2001; 54(6):669-674. ,9, Bosch L, Schinckx V, et al. Protective effect of parvalbumin on excitotoxic motor neuron death ,J,. Exp Neurol, 2002; 174(2):150- 161.