低聚半乳糖检测方法研究进展

低聚半乳糖检测方法研究进展 食品研究与开发 2013 年 4 月专题论述 Food Research And Development 第 34 卷第 8 期 115DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2013.08.032 低聚半乳糖检测方法研究进展 张志国 (内蒙古蒙牛乳业 ) 内蒙古 呼和浩特 011500 (集团 股份有限公司研发中心， ) 摘 要: 详细归纳了检测低聚半乳糖的薄层色谱法、 在参阅国内外大量文献的基础上， 液相色谱法、 气相色谱法、 离子 色谱法等各自的优缺点及研究进展。认为今后低聚半乳糖的检测方法应该以 AOAC 45.4.12-2001.02 方法为基础，研 为建立食品中低聚半乳糖的国标检测方法提供参考依据。 究适用性强的检测方法。 关键词: 检测方法; 低聚半乳糖; 研究进展 Research Progress of the Analysis Methods on Galactooligosaccharides ZHANG Zhi-guo (R amp D Center ， Inner Mongolia Mengniu Dairy (Group ) Co. ， Ltd. ， Huhhot 011500 ， Inner mongolia ， China ) Abstract:According to the references ， the respective advantages and disadvantages and research progress of galactooligosaccharides detected on thin -layer chromatography ， gas chromatography ， liquid chromatography and ion chromatography was summarized in detail. The conclusion was that the AOAC 45.4.12 2001.02 method will be developed. The present paper could provide reference for the establishment of GB of galactooligosaccharides detection method on food. Key words:galactooligosaccharides ; analysis methods ; research progress 低聚半乳糖 GOS)是 由 外标法检测存在一定的困难，所以低聚半(Galactooligosaccharides， 乳糖检测技 不能2 个8 个单糖通过 β-糖苷键连接形成直链寡糖， 术是低聚糖检测研究的重点。下面从国内外低聚半乳被人体上消化道消化吸收，可以直接进入大肠。经过 糖检测技术的研究情况、存在的问题和研究方向分别国内外科学家的大量研究，低聚半乳糖具有低能量、 进行介绍。促进肠道双歧杆菌的增殖、改善矿物质元素的吸收和防止骨质减少、 改善脂质代谢、 预防、 治疗便秘、 低致龋 1 低聚半乳糖检测方法研究现状齿性、 改善营养状况、 生成营养物质， 增强 提高免疫力、 低聚半乳糖属于低聚糖，而低聚糖的分离检测技抗肿瘤和抗衰老等营养功能 1-2 。 术一直是科研工作者研究的重点。Richard C et al 5在 低聚半乳糖在日本已经广泛的被用作甜味剂、糖 1986 年采用纸色谱检测了婴儿配方乳中的乳果糖和的替代品、食品原料、功能性食品原料，在各类食品中 Takamitsu chaka et al6采用薄层色谱法分 大豆低聚糖，添加。我国卫生部已经批准 GOS 为新资源食品，并且 离了藻朊酸纤维低聚糖，Splechtna B et al7采用薄层色 乳制品、允许添加在婴幼儿食品、 焙烤食品、 饮料、 糖果 谱法分析了转糖基产物中的低聚半乳糖。中(中华人民共和国卫生部公告 2008 年第 20 号，中华 对于低聚糖的分离检测技术，高效液相色谱法研 )人民共和国卫生部公告 2007 年第 12 号 。 3 究相对多一些 8，高效液相色谱法主要利用低聚糖的 因为低聚半乳糖是一系列半乳糖基低聚糖的混 易溶特性，在糖柱、氨基柱、凝胶柱上分离效果较好的合物， 有 聚合度从 2 到 8 不等， 15 种以上的组分 ，用 4 特点，一般采用示差折光检测器检测。随着技术的进 步， Antonopoulos A et al 9用蒸发光散射检测器(evapo,基金项目:呼和浩特市重大科技专项 ) 国家 (2011-重-I-13 ; “十二五”高技术研究发展(863 计划 项目 ) (No.2012AA10160504) ) ELSD 检测低聚糖的研 rative light scattering detection，作者简介:张志国(1977— ， (汉 ， ) 男 ) 高级工程师，硕士，研究方向:食 究， 蒸发光散射检测器比示差折光检测器检出限高 12品检测技术研究。 具有 比较好的前景。Hirotaka Kakita et al10把 个数量级， 张志国:低聚半乳糖检测方法研究进展 专题论述 116单糖和低聚糖进行荧光素衍生后，利用 HPLC 法检测 吴昊等21对高效薄层色谱法分析低聚半乳糖及其取得了较好的效果。 衍生物进行了系统的研究。试验对薄层厚度、固定相 随着技术的发展，也有用质谱进行低聚糖分离和 盐效应、硅胶粘合剂浓度、点样的技巧以及展开剂的结构分析的研究。林勤保等 用气相色谱-质谱联用法 11 选择、显色剂优化等进行了优化试验，确定了适合的测定了大枣低聚糖的单糖组成，结果发现大枣低聚糖 方法。但是方法适合高低聚半乳糖含量和低的乳糖和 鼠李糖、的单糖组成为阿拉伯糖、 甘露糖、 核糖、 半乳糖 半乳糖含量的样品。和葡萄糖，同时测定了大枣中单糖的组成成分为果糖 1.2 气相色谱法 取得了较好的效果。和葡萄糖， Broberg A 用高效液相 12 随着气相色谱法和衍生技术的发展，也有人采用色谱串联离子阱质谱进行了低聚糖的分析。Ying Liu 气相色谱分离检测碳水化合物，由于糖的高分子量和et al 采用液相色谱和液相色谱串联电喷雾电离质谱 13 沸点高的特点，先把多糖水解成单糖，然后采用衍生进行了低聚糖分离和鉴定。 试剂把单糖衍生成容易气化的物质，采用气相色谱分 另外，冯咏梅等 14还采用 001×7 阳离子交换树脂 离定量，所以气相色谱主要进行单糖组成及含量的分柱层析分离提纯低聚半乳糖 ) (GOS 混合物，然后采用 操作相对复杂。 析，薄层色谱分析纯化结果。Kamoda S et al 采用激光诱 15 刘建福22-23把经过分离纯化的低聚半乳糖样品水导荧光检测器分析经过毛细管电泳分离的 N-连接低 衍生后用气相色谱分析。 解、 试验采用 OV1701 石英毛聚糖，也取得了良好的效果。还有 Dreisewerd K et al 16 细管柱(30 m， 0.32 mm ， I.D. ) 根据测定的葡萄糖和半采用薄层色谱板分离生牛乳中的低聚糖，然后用基质 乳糖峰面积之比确定分离产物的大致结构，但是没有辅助激光解吸电离飞行时间质谱完成分析，也取得了 给出定量方法。较好的结果。 1.3 液相色谱法 下面根据研究较多的分析方法具体介绍一下检 采用高效液相色谱检测单糖和低聚糖，是目前较测低聚半乳糖的方法，有薄层色谱法(Thin Layer Chro, 为普遍的方法。前面介绍的研究人员还采用液相色谱 ) 气相色谱法、matograpy 、 离子色谱法。 液相色谱法、 法和薄层色谱项结合分析了转糖基产物中的低聚乳1.1 薄层色谱法 李玉梅等17还用 HPLC 分析了转糖基产物中 糖。比如， 李玉梅等17对低聚半乳糖含量为 30 的 β-半乳 的低聚半乳糖。 以三蒸水 将糖浆用 0.22 μm 滤膜过滤，糖苷酶转糖基发酵产物进行了分析。利用薄层色谱法 作为流动相，柱温 80 ?，色谱柱为 Aminex HPX-42A和 HPLC 法两种方法。薄层色谱法采用 Silica gel 60 制 ) (300 mm×7.8 mm 糖分析柱。陆文伟等18也采用 HPLC薄层板，展开剂为: (体积比) 正丁醇?乙醇?水5 ? 3 ? 2 ， 法测定了转糖基产物中的低聚半乳糖含量，流动相用薄层显色剂为: 硫酸溶液0.5 3， 20 5-二羟基甲 5 mmol/L 硫酸，柱温为 50 ?，色谱柱用 Aminex HPX苯，糖显色条件为: ?烘烤 3 min5 min，然后用 120 87H。ImageJv1.28 软件进行定量分析。 Barroso Begona et al 24 采用在线高效液相色谱/飞 陆文伟等18采用薄层色谱法，并把展开剂调整为: 行时间质谱联用仪分析了糖蛋白来源的低聚糖的结 (体积比 ，正丁醇?正丙醇?乙醇?水2 ? 3 ? 3 ? 2 ) 分析了转 构和类型，分析了 N 连接和 O 连接的低聚糖，取得了糖基产物中的低聚半乳糖含量(含量超过 20 。 ) 较好的效果。 许牡丹等 采用上行薄层色谱法以硅胶 G 做薄层， 19 罗倩等25研究了利用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉正丁醇?水 85 ? 15 作展开剂，用苯胺-二苯胺-磷酸溶 酮(PMP 对低聚半乳糖柱前衍生化的方法， ) 并采用硅液作为显色剂检测转糖基产物中各个糖组分含量(低 胶柱层析结合薄层层析，分离检测原料糖浆中低聚半聚半乳糖含量大于 20 。 ) 乳糖，采用紫外光检测器在波长 245 nm 条件下，可以 李正义等20采用了李玉梅等17的相同薄层色谱方 检测半乳糖、葡萄糖、乳糖、三糖、四糖、五糖。从而进法分析了低乳糖牛奶中的低聚半乳糖含量，由于乳糖 行间接定量。水解率很高， 超过 70 ， 含量超过 20 ， GOS 所以乳糖的 吴红京等26采用反相高效液相色谱仪，以水作为干扰很少。而采用 Aminex HPX-42C ) (300 mm×7.8 mm 糖 流动相，分离分析了淀粉经过酶水解得到的含 26 个分析柱，超纯水作流动相，柱温 70 ?的 HPLC 条件检 也取得了比较好的结果。 葡萄糖聚合物的混合物，测。转移二糖和乳糖的色谱峰重叠，造成低聚半乳糖 李静芳等27研究了高效液相色谱法测定乳制品及含量的检测结果偏低， 乳糖含量的检测结果偏高。 糖浆中低聚半乳糖含量的方法。以水和乙腈为流动专题论述 张志国:低聚半乳糖检测方法研究进展 117相，用氨基柱将葡萄糖、半乳糖和乳糖与其他物质分 响检测结果准确性的最重要因素(该已经做了说离，用示差折光检测器检测定量。通过检测计算低聚 明)。食品尤其是乳粉中的乳糖含量 ) (?40 g/100 g 远半乳糖酶解成的半乳糖含量，来计算样品中低聚半乳 高于添加的 GOS 含量 ) 这样由乳糖水解 (?1 g/100 g ， 半乳糖、糖含量。葡萄糖、 乳糖和低聚半乳糖的相对标 来源的半乳糖含量高于 20 g/100 g。而由 4.16 1.16 4.26 到的半乳糖含量GOS 水解得准偏差分别为 2.72 、 、 、 。此法的 不超过总半乳糖含量的 5 ，从样品线性相关系数为 0.999 0,0.999 5，回收率达到 95 , 处理、仪器分析的结果分析这 5 增量可以计为非常110 。该方没有解决水解后样品溶液中半乳糖和葡 好的平行结果，不能用来计算 GOS 的含量，因此该方萄糖分离的问题，也没有确定半乳糖换算成低聚半乳 法不适用于乳糖含量高的样品。 推广意义不大。糖的换算系数， 1.4.2 其他的离子色谱检测方法1.4 离子色谱法 采用离子色谱法检测低聚半乳糖含量的研究基 离子色谱法检测单糖和低聚糖是比较新的检测 本上都是以 AOAC 45.4.12-2001.02 标准为基础进行 具有灵敏度高、技术， 分离效率好等优点。离子色谱法 流动相梯度和浓度、 的。主要在色谱柱型号、 β-半乳糖检测低聚半乳糖首先是美国 AOAC 官方公布的标准 苷酶的添加量等方面进行了研究，也有科研人员利用方法，其他的关于离子色谱法检测低聚半乳糖的研究 离子色谱-质谱联用进行了一些研究。主要是对 AOAC 标准方法的改进研究。 Bruggnk C et al29用离子交换色谱和单四极质谱串1.4.1 美国 AOAC 45.4.12-2001.02 标准28 联做了一些 研究，并认为该方法可以 分 离 分 析 了 AOAC 45.4.12 -2001.02《Determination of trans - chicory coffee、蜂蜜、啤酒样品中的单糖、二糖、三糖和Galactooligosaccharides (TGOS)in Selected Food Prod, 低聚糖。ucts》标准，依据的理论基础是利用特定、专一的 β-半 李建文等 30 在 AOAC-2001.02 方法基础上，优化乳糖苷酶水解样品中的乳糖和低聚半乳糖，产物是葡 淋洗液梯度，以高效离子色谱-脉冲安培检测法测定萄糖和半乳糖，再利用样品中检测出的乳糖含量计算 了原料糖浆中的低聚半乳糖含量。出乳糖水解来源的半乳糖含量。最后用样品溶液中总 用水、 nmol/L 徐莉等31参考 AOAC-2001.02 方法， 250半乳糖含量减去游离的和乳糖水解来源的半乳糖含 NaOH 溶液和 1 mol/L 乙 酸 钠 溶 液 梯 度 淋 洗 ，选 用量，然后用半乳糖增量乘以一个系数计算得 到样品中 (2 ) CarboPac PA10 mm×250 mm 色谱柱和安培检测器，低聚半乳糖 ) (GOS 的含量。该标准的操作和计算步骤 研究了离子色谱法测定糖浆中低聚半乳糖含量的方如下: 法，测定了糖浆中各组分(乳糖、半乳糖、葡萄糖和低 ? 用 IC 测出游离的半乳糖和乳糖的量; ) 聚半乳糖 的含量。 ? 计算乳糖来源的半乳糖的量; ? 水解样品中的乳糖和 TGOS; 2 现有方法存在的问题 ? 用 IC 测出水解液中总半乳糖的量; 2.1 样品通用性 ? 计算 GALGOS GALT , GALfree , GALLAC; 虽然现在有很多技术进行低聚半乳糖的检测，但 ? 计算 TGOS k × GALGOS。 是主要针对低聚半乳糖原料糖浆、转化糖产物等低聚 注: (180162 n (180 n ， 是低聚半乳糖 这里 k )/ )n 半乳糖含量较高的样品。包括 AOAC 标准在内，涉及分子中半乳糖基的平均数。 到的食品样品也主要是乳糖含量较低和半乳糖含量 该标准方法用于低聚半乳糖的检测存在 2 个技术 较低的食品样品中低聚半乳糖含量的检测。问题: 2.2 外标法的适用性 ) 1 AOAC 45.4.12-2001.02 标准中的计算系数是由 工业化生产使用乳糖酶的来源不同，各生产企业低聚半乳糖的聚合度计算得到的。可是在试际检测 采用的生产工艺也存在一定的差别，造成了低聚半乳中，由于不同生产工艺造成的低聚半乳糖各组分的复 糖组分种类.