肠道病毒71型VP1蛋白二级结构及B细胞表位的预测

肠道病毒71型VP1蛋白二级结构及B细胞位的预测 肠道病毒71型VP1蛋白二级结构及B细胞 表位的预测 2011,27(10) 中国人兽共患病 chineseJournalofZoonoses9O5 文章编号:1002—2694(2011)10—0001—05 肠道病毒71型VP1蛋白二级结构 及B细胞表位的预测* 王锦,许国章,倪红霞 摘要:目的预测C4基因亚型肠道病毒71型的VP1蛋白二级结构及B细胞表位,为EV71疫苗研制提供理论基础. 本研究将宁波地区EV71分离株与国内外EV71代表株进行同源性分析和并构建亲缘进化树.以VP1基因序列为材 料,应用EX—PASY服务器上的GOR4,SOPMA两种方法分析预测蛋白质二级结构,并结合蛋白质的亲水性,柔韧性,表面可 能性等指标综合评价VP1蛋白的B细胞抗原表位.结果同源性分析和亲缘进化分析得出,2010年宁波EV71分离株属于 C4a基因亚型,与基因库检索到的C4a基因亚型代表株核苷酸和氨基酸同源性较高,分别为93.6%,99.3和98.3, 100.VP1蛋白二级结构以无规则卷曲和p一片层为主,有多处抗原指数较高的区段,结合亲水性,柔韧性,表面可能性等指 细胞抗原表位在第39,40,159,167,212,220,287,标,综合预测VP1蛋白的B 290位氨基酸残基的可能性较大.结论 EV71VP1蛋白多个区段具有抗原潜力通过生物信息学方法预测VP1蛋白二级结构及B细胞表位为EV71疫苗研制提供理 论基础. 关键词:肠道病毒71型;VP1;蛋白质二级结构;B细胞表位 中图分类号:R3732文献标识码:A PredictiononsecondarystructureandBcell epitopeofenterovirustype71forVP1gene WANGJin,XUGuo—zhang,NIHong—xia (MedicalSchoolofNingboUniversity,Ningbo315211,China) ABSTRACT:ThepurposeofthisstudywastopredictthesecondarystructureandBcellepitopesofenterovirustype71of VP1GeneofC4subgenotype,8oastoprovidetheoryevidenceforthestudyofvaccinepreparationforEV71.EV71strains wereisolatedfromhand,footandmouthdiseaseinNingboin2010.HomologyandphylogeneticanalysisbasedonVP1with othersEV71havepublishedinGenBankwereconducted.ThesecondarystructureofEV71basedonVP1wasanalyzedusing theGOR4andSOPMA,andtheBcellepitopeofEV71waspredictedbycombiningthehydrophilicity,flexilityandsurface probability.TheNingbostrainsharedthehighesthomologyofnucleotideandaminoacidwiththetypeC4awere93. 6一 99.370and98.3一 100,phylogeneticanalysisrevealedthatNingbostrainsclusterdwithintheC4aevolutionbranchofC4 subgenotype.ThesecondarystructureofEV71VP1showedrandomcoilsand3-sheetmainlywithanumberofantigenindex highersection.TheBcellepitopeswasprobablylocatedattheregionsof39—40,159— 167,212-220,and287290ofVP1Gene. ThesecondarystructureandBcellepitopesofEV71VP1couldbepredictedbybioinformaticsmethods,whichprovidingtheorv evidenceforthestudyofvaccinepreparationforEV71. KEYWORDS:Enterovirus71;VP1;proteinsecondarystructure:Bcellepitope 肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)是小 RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒(Enterovir— US,EV)A组成员,1969年由Schmidt等从美国加利 *浙江省卫生厅医药卫生科学研究基金资助项目(2009A190);宁波 市科技局重大科技专项资助项目(2009C50008) 通讯作者:许国章,Email:xugz@nbcdc.org.cn 作者单位:1.宁波大学医学院,宁波315211; 2.宁波市疾病预防控制中心,宁波315010 福尼亚州患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中 分离到.分子流行病学研究显示,EV71的VP1蛋 白不但具有与血清型相对应的遗传多样性,并且是 特异性中和表位所在区域,直接影响病毒的抗原性. 目前,我国流行的EV71以C4亚型为主,采用生物 信息学方法对EV71分离株进行种系分析以及VP1 蛋白二级结构和B细胞表位预测.旨在为EV71疫 906中国人兽共患病 苗的研究提供理论依据,同时为各类诊断试剂的研 发提供依据. 1材料与方法 1.1样本来源2010年宁波市疾病预防控制中心 病毒研究所共收集全市177份HFMD患者标本,患 者的年龄范围在0,24岁,男女比例是2.04:1. 其中粪便,咽拭子,肛拭子,脑脊液标本各89,26, 59,3份.临床标本接种非洲绿猴肾细胞(VERO) 进行病毒分离,置于36?培养,每天观察细胞培养 管的细胞病变效应(CPE)并,每份标本至少传 3代,如果出现EV特异性CPE则保存于一70?条 件下待用.本研究的31株EV71均来自此次分离 的EV71流行株,其它EV71和柯萨奇病毒A组16 型(Coxsackievirus,CoxA16)代表株来自NCBI的 GenBankDatabase. 1.2病毒分离物VP1编码区RT-PCR基因扩增和 鉴定取分离培养液200FI采用QIAGENReansy MiniKit试剂盒提取RNA,并进行全长VP1编码 区的核苷酸序列测定和分析.特异性引物序列: VPl—F:5'一GCAGCCCAGAAGAACTTCAC一3'; VPl_R:5'一ACCACTCTAAAGTTGCCCAC一3', RT—PCR反应参数:42?反转录30min;95?预变 性4min;以95?45S,58oC90s,72?1min扩增35 个循环;72?后延伸10min.使用1.25琼脂糖凝 胶电泳鉴定PCR产物. 1.3序列测定扩增产物委托英潍捷基(上海)贸 易有限公司进行基因测序. 1.4EV71VP1区同源性和亲缘进化分析VP1 序列分析整理和同源性分析使用DNAStarV7.10 软件;多序列比对和邻接法(neighbor—joining,NJ) 构建系统发生树使用Mega4.0.2软件口. 1.5VP1蛋白二级结构预测对31份分离株的 VP1序列分别应用EX—PASY服务器上的GOR4[2] 和SOPMA两种方法分析预测EV71VP1蛋白的 二级结构]. 1.6EV71VP1蛋白亲水性,柔韧性,表面可能性 和B细胞抗原表位的预测应用DNAStar软件的 Protean程序,采用Hopp—Woods和Kyte—Doolittle 方法预测氨基酸的亲水性,采用Karplus—Schultz和 Emini方法预测柔韧性及表面可能性,采用Jame— son—wolf方法预测潜在的B细胞抗原表位,综合评 价VP1蛋白的B细胞抗原表位. 2结果 2.1宁波EVT1流行株VP1蛋A同源性和遗传进 化分析将31株EV71病毒分离物,进行全长VP1 区的核苷酸序列测定分析,结果显示31株EV71 VP1区核苷酸序列长度均为891bp,编码297个氨 基酸,没有核苷酸的插入和缺失.本研究的3l株 EV71VP1序列虽有一定差异,但核苷酸和氨基酸 同源性很高,分别在97.1,100和99.3, 100之间,其中4株的同源性为100;与基因库 (GenBankDatabase)检索到各基因型和基因亚型 EV71代表株VP1序列进行同源性分析发现,31株 EV71的VP1蛋白与C4a基因亚型的核苷酸和氨 基酸同源性最高在93.6,99.3和98.3, 100之间;与CoxAl6核苷酸和氨基酸同源性最低 在62.8,63.3和71.8,72.5之间.宁波 分离株与2008—2010年中国大陆流行株的核苷酸 序列具有高度同源性.根据EV71的VP1编码区 核苷酸序列,运用Mega4.0.2软件将宁波EV71分 离株与GenBankDatabase检索到EV71代表株构 建亲缘进化树(见图1),宁波分离株属于C4基因亚 型的C4a进化分支,并存在多个传播链,与2008 2010年国内其他地方的分离流行株亲缘关系较近, 进化途径相似,说明2010年EV71宁波株对近几年 中国大陆EV71流行株具有一定代表性. C4a Ic曲 Ic2 Ic3 l' l? . 1~oxAl6 图1EV71分离株和其他各个基因型EV71代表株全长 VP1区亲缘进化树 注:?代表本研究中的EV71宁波株 Fig.1ThephylogenetictreeofVP1geneamong31strains andtherepresentativestrainsofEV71 ?()nbehalfofthestudyofstrainsEV71inNingbo 2.2EV71VP1二级结构运用EX—PASY服务 1O期王锦等:肠道病毒71型VP1蛋白二级结构及B细胞表位的预测907 器上的GOR4和S()PMA两种方法预测EV71 VP1蛋白的二级结构,两种方法的预测结果无显着 差异,均提示EV71VP1的二级结构以无规则卷曲 和J3一片层为主,并有多个a一螺旋的形成.31份标本 VP1蛋白的无规则卷曲重合区域主要位于26,31, 37,4O,54,6O,71,76,96,106,132,133,156, 157,16O,166,172,178,184,189,208,212,225 , 231,239,246,262,270,274,282位氨基酸;J3一 片层重合区域主要位于68,70,93,94,109,113, 135,139,203,206,221,223,232,238,247, 253,294~296位氨基酸;一螺旋重合区域主要位于 16,2l,46,51,63,67,8O,86,116,126位氨 基酸. 2.3EV71VP1蛋白亲水性,柔韧性,表面可能性 和B细胞抗原表位的预测对本研究的31份氨基 酸序列分别进行亲水性,柔韧性,表面可能性分析, 并根据各项指标综合预测B细胞抗原表位. 2.3.1亲水性分析运用Kyte—Doolittle和 Karplus—Schulz方法分析VP1蛋白的亲水性,结果 显示该蛋白存在较多亲水性区域,56,64,118, 124,159,169,212,222位的氨基酸亲水性指数普 遍最高,提示该区域暴露于表面并成为抗原表位的 可能性较大. 2.3.2柔韧性分析运用Karplus—Schulz方法分 析蛋白的柔韧性,该蛋白骨架的柔韧性区域较多且 呈均匀分布,主要分布在26,36,39,44,98,105, l57,168,206,220,237,245,280,294位氨 基酸. 2.3.3表面可能性分析运用Emini方法分析蛋 白的表面可能性,结果显示该蛋白氨基酸的表面可 能性较大,主要分布在37,4O,159,167,2l2, 221,241,245,264,271位氨基酸,易被溶剂分子 接触,成为抗原表位. 通过Antigenicindex—Jameson—Wo1f法预测B 细胞抗原决定簇:结果显示该蛋白存在多个抗原可 能性较大的区域,并均匀分布,其中第35,43,53, 65,70,80,118,l24,158,169,206,224,238, 245,262,270,275,293的抗原指数较高,提示该 区段含有潜在的抗原决定簇.结合VP1蛋白的亲 水性,柔韧性,表面可能性_5的重合区域,并分析 VP1的蛋白质二级结构,预测VP1蛋白以第39, 40,159,167,212,220,287,290位氨基酸成为抗 原表位的可能性较大.(由于版面所限,图2为其中 4株EV71的亲水性,柔韧性,表面可能性软件截图 示例).图2可见,不同株C4基因亚型EV71VP1 的B细胞抗原表位软件分析结果基本一致. It0 — lil0 — 150 嘲 .J釉啪抽25o:J5o2口.擒IJ籀1田啪硐瑚 ::..嘶 ?叫?叫叫.一一?- — 小—一 Fig.2Analysisofhydrophilicity,flexilityandsurfaceprobabilityinVP1gene 3讨论 EV71分子流行病学显示,EV7l的VPI蛋白 是最重要的衣壳蛋白,不但具有与血清型相对应的 遗传多样性,并且是特异性中和表位所在区域,直接 影响病毒的抗原性,研究EV7lVP1蛋白的B细胞 抗原表位对疫苗研究具有重要意义j.VP1蛋白 通常用于病毒的基因型别鉴定和遗传进化分析,目 前发现EV71至少包括l1个基因型(A,B1,B5,C1 , C5),中国大陆EV71流行株以C4亚型为主.本 研究的3l株EV71与国内正在流行的C4a基因亚 型的EV7l同源性较高,亲缘关系近.构建亲缘进 化树也显示宁波分离株属于C4基因亚型的C4a进 化分支,并存在多个传播链,与2008—2010年国内 其他地方的分离株距离较近],有共同进化趋势. 宁波株与C4a亚型氨基酸的高度同源性,说明使用 宁波流行株来预测中国大陆流行株的B细胞抗原 表位具有可行性. 应用生物信息学方法预测蛋白质的抗原优势表 位,并通过体外合成其肽段进行试验验证,是目前获 得抗原优势表位肽段的一种重要方法,即省时省力, 9O8中国人兽共患病 又经济高效[9..本研究应用蛋白质二级结构,亲 水性,柔韧性,表面可能性来预测EV71C4a基因亚 型中国大陆代表株的B细胞抗原表位.EV71VP1 蛋白的二级结构以无规则卷曲和J3一片层为主,a一螺 旋较少,而影响蛋白质抗原表位形成的主要因素为 具有较多的无规则卷曲,与理论相符.结合EV71 VP1蛋白的亲水性,柔韧性,表面可能性分析的重 合区域,第39,40,l59,167,212,220,287,29O 位氨基酸残基成为抗原表位的可能性较大.除了这 四个区段,还存在其他抗原指数较高的区段,在蛋白 成熟的过程中许多抗原指数高的区段会发生构象变 化,被外层的氨基酸残基或糖基所遮蔽,所以预测结 果仍需要进一步实验证明.图2可见,不同株C4a 基因亚型EV71VPt的B细胞抗原表位软件分析 结果基本一致,可以推测同一基因亚型内抗原表位 非常相近. EV71感染可引起多种临床症状,其感染引发 的神经症状常引起儿童死亡,长期以来人们研究 EV71的毒力位点,但并未得到确定答案.McMinn 等对1999年澳大利亚流行的C2基因亚型EV71 VP1区进行分析,发现表现为HFMD的分离株与 具有神经毒性的分离株主要区别在于第170位氨基 酸的不同,前者为丙氨酸,后者为缬氨酸,可能是此 氨基酸的变化,改变的VP1蛋白的空间结构,从而 使毒力发生根本性改变,但这点并未得到实验证实. 本研究的EV7l为C4a基因亚型,其170位氨基酸 为丙氨酸,生物学软件综合分析发现其抗原潜力并 不大,将170位的丙氨酸人为更改为缬氨酸后,抗原 潜力无明显改变,第170位氨基酸的是否为毒力位 点仍需动物实验来验证,并且不同型别EV71的毒 力位点可能存在差异.FooDGG根据EV71VP1 蛋白的氨基酸序列合成了95段有部分重叠的肽段, 与载体连接后免疫小鼠,取血清进行中和抗体试验, 其中SP55(163,177)和SP70(208,222)片段能够 诱发中和抗体,其中SP70具有高度保守性,成为 EV71多肽疫苗的候选肽段.SP55和SP70分别与 本次预测的158,169和212,221区段有一致区 域.朵建英等?研究EV71亚单位疫苗,其中Vac6 用于小鼠攻毒试验后5d,肌肉组织,小肠组织病理 观察和免疫组织化学检测不到病理改变和病毒抗原 的存在,对幼鼠的保护效果明显,起到与灭活全病毒 疫苗相同的抗病毒保护作用.Vac6包含的23, 53,47,83,108,149,248,292为氨基酸片段,与 本次预测结果有核心重合区域.同时说明生物信息 学方法对抗原位点的预测具有一定可行性.本次研 究为EV71的抗原性分析提供理论材料,有助EV71 新型疫苗的研究和生物学试剂的研发. 参考文献: [1]TamuraK,DudleyJ,NeiM,eta1.MEGA4:MolecularEvoh tionaryGeneticsAnzlysis(MEGA)softwareversion4.O[J].Mol BidEvol,2OO7,24:l596一l599. 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