蛹虫草菌丝体中腺苷提取工艺的优化_药学论文【精品论文】

蛹虫草菌丝体中腺苷提取工艺的优化_药学论文【精品论文】 蛹虫草菌丝体中腺苷提取工艺的优化_药学论文 作者:牛双 高翔 安金双 郭憬憬 滕利荣 逯家辉 【摘要】 目的利用单因素及响应面分析法优化蛹虫草菌丝体腺苷水提工 艺。方法通过单因素实验选取实验因素与水平，在单因素实验的基础上，以水 料比、提取温度、提取时间为响应因子，以腺苷得率为响应值，进行3因素3 水平的响应面实验。结果蛹虫草菌丝体腺苷水提最佳工艺条件为:料水比 1?38，提取温度44?，提取时间为2.3 h。在该最佳工艺条件下蛹虫草菌丝体 腺苷得率可达1.44 mg/g，与理论 计算 值1.42 mg/g基本一致。结论经响应 面法优化所得模型可较好地预测蛹虫草菌丝体腺苷的得率。 【关键词】 蛹虫草; 腺苷; 水浸提; 响应面分析法 Abstract:Objective One-factor tests and Response Surface Methodology (RSM) were applied to optimizing the water extraction conditions of Cordyceps militaris mycelium adenosine. MethodsExperiment factors and levels were first selected by one-factor tests. On the basis of this, the ratio of water to sample, extracting temperature, extracting time were chosen as the factors in RSM and each factor in the design was studied at three different levels. ResultsThe optimum extraction conditions were confirmed as follows:the ratio of sample to water 1: 38, extracting temperature 44?, extracting time 2.3 h. In this study, the optimized extraction conditions produced theoretically extraction rate of 1.42 mg/g and in practice 1.44 mg/g. ConclusionThe good agreement between the predicted and experimental results verified the validity of the model and existence of an optimal point. Key words:Cordyceps militaris; Adenosine; Water extraction; Response Surface Methodology 蛹虫草Cordyceps militaris(L.ex Fr.)Link又名北冬虫夏草、北虫草等 ,1,，与 冬虫夏草同属异种，是虫草属的模式种,属于子囊菌亚门虫草属，是 其寄生在昆虫纲鳞翅目夜蛾科昆虫蛹体上所长出的子座与僵死蛹体的复合体。 作为一种具有多种药理功能、抗癌活性的药用真菌蛹虫草,2,4,，随着人们 逐渐发现和认识其滋补疗效和提高人体免疫功能的功效，它的开发利用备受关 注。 腺苷是合成三磷酸腺苷(ATP) 的主要原料，ATP 已被广泛应用于 治疗 心 脏功能不全、脑动脉硬化及肌肉萎缩等症。本实验室通过液体深层发酵获得蛹 虫草菌丝体，并利用单因素和响应面法对蛹虫草菌丝体腺苷提取工艺条件进行 优化，以提高其腺苷得率，为蛹虫草腺苷产业化生产奠定了一定的理论基础。 1 与方法 1.1 材料、试剂与设备蛹虫草(CGMCC 5.0699)，购于 中国 科学 院微生物研究所。甲醇(色谱纯)，葡萄糖，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1。磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均为分析纯。全自动在位灭菌发酵系统，真空冻干机，德国Eppendorf 5810R型高速冷冻离心机，电热恒温水浴锅，漩涡混合仪，高效液相仪， 电子 天平等。 1.2 方法 1.2.1 菌丝体的预处理将液体深层发酵获得的蛹虫草菌丝体真空冷冻干燥，粉碎，过60目筛用于实验。 1.2.2 菌丝体腺苷的提取方法准确称取0.15 g经预处理后的菌丝体，加蒸馏水在恒温水浴锅内浸提一定的时间。8 000 r/ min，离心10 min，分离上清液用于腺苷含量测定。 1.2.3 腺苷含量的测定方法根据2005版《中国药典》中介绍的方法，利用高效液相色谱法测定腺苷的含量,5,。流动相为pH 6.5的磷酸盐缓冲液?甲醇(体积比)=85?15;色谱柱为C18，流速1 ml/min，检测波长260 nm，柱温35?，进样量10 μl。 1.2.4 菌丝体腺苷得率的计算 腺苷得率(W/W)=腺苷质量(mg)菌丝体质量(g) 1.2.5 菌丝体腺苷单因素提取实验分别以不同的提取温度、料水比、提取时间作单因素实验，考察各单因素对腺苷得率的影响。 1.2.6 菌丝体腺苷提取的中心组合实验根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理,6,，在单因子实验的基础上，确定中心组合实验的因素与水平，以腺苷得率为响应值，通过响应面分析对提取工艺条件进行优化。中心组合实验水平与因素设计如表1 所示。 表1 中心组合设计的因素与水平(略) 2 结果 2.1 提取单因素对菌丝体腺苷得率的影响 2.1.1 料水比对菌丝体腺苷得率的影响菌丝体按料水比1?10，1?20，1?30，1?40，1?50分别加入蒸馏水，80?水浴浸提2 h。不同料水比腺苷得率结果如图1所示。 从图1可以看出，腺苷得率随料水质量体积比的增加而增加，在料水质量体积比小于1?20时，随料水质量体积比的增加，腺苷得率显著增加;在料水质量体积比在1?20,1?40时，随料水质量体积比的增加，腺苷得率缓慢增 加;在料水质量体积比在大于1?40时，腺苷得率稍有下降。因此，料水质量体积比以1?40较为适宜。 图1 料水比对腺苷得率的影响(略) 2.1.2 提取温度对菌丝体腺苷得率的影响菌丝体按料水比1?40加入蒸馏水，分别于提取温度20，30，40，50，60，70?下水提2 h。不同提取温度下菌丝体腺苷得率结果如图2所示。 图2 提取温度对腺苷提取率的影响(略) 从图2可以看出，提取温度从20?到30?腺苷得率增加显著;提取温度从30?到40?腺苷得率增加缓慢;提取温度从40?到50?腺苷得率基本不变;提取温度从50?到70?腺苷得率下降显著。可见，温度低不利于腺苷的溶出，温度太高，腺苷又会分解，因此一定要选出最佳的提取温度才能保证腺苷较高的得率。考虑到能耗及维护腺苷的结构稳定性，提取温度应控制在40?较为合适。 2.1.3 提取时间对菌丝体腺苷得率的影响在料水比1?40、提取温度40?条件下，分别浸提0.5，1，1.5，2，2.5，3，4 h，不同提取时间下菌丝体腺苷得率结果如图3所示。 图3 提取时间对腺苷得率的影响(略) 从图3可以看出，提取时间对菌丝体腺苷的提取效果有较大的影响。提取时间小于2.5 h时，随着提取时间的延长，腺苷得率增加明显，当达到2.5 h后，随着提取时间的增加，腺苷得率的增加趋于平缓。因此，提取时间以2.5 h为宜。 2.2 响应面分析法对蛹虫草菌丝体腺苷提取工艺的优化为了确定菌丝体腺苷的最佳提取工艺条件，采用响应面分析方法进行优化提取条件。根据单因素实验结果，以料水比、提取温度、提取时间3个因素为自变量，菌丝体腺苷得率为响应值，采用响应面分析法在3因素3水平上对菌丝体腺苷提取过程进行优化，以达到最大限度提取菌丝体腺苷的目的。实验因素与水平设计见表1。 响应面实验及结果见表2。 对提取时间Z1、提取温度Z2和料水比Z3各水平进行如下编码: X1=(Z1-2.5)/0.5，X2=(Z2-40)/10，X3=(Z3-40)/10，以X1，X2，X3为自变 量，以腺苷得率Y为响应值，分析方案及实验结果见表2。 表2 响应面分析方案及实验结果(略) 表2中实验1,12为析因实验，13,15为中心实验。15个实验点分为析因点和零点,其中析因点为自变量取值在X1，X2，X3所构成的三维顶点;零点为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差。采用SAS RSREG 程序 对所得数据进行回归分析，回归分析结果见表3。 对表3中数据进行回归分析，获得蛹虫草菌丝体腺苷提取率对编码自变量 提取时间、提取温度、料水比的二次多项回归方程: Y=1.403 33-0.024 13X1+0.054 5X2-0.019 63X3-0.067 92X12-0.050 75X1X2-0.007X1X3- 0.085 17X22 + 0.001 25X2X3-0.038 42X32 表3 回归分析结果(略) 回归方程中各变量对响应值影响的显著性由F检验来判定，P的值越小，则相应变量的显著程度越高。由表3可以看出，方程中X2，X12，X1X2，X22影响最为显著。在各影响因素中，提取温度对腺苷提取率的影响最大。试验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项和交互项对响应值都有很大的关系，说明方程的拟合是充分的。回归方程也是高度显著的，相关系数R2为0.9245， 可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。 根据回归分析结果做出相应的响应曲面图及其等高线图，以确认提取时 间、提取温度、水料比3因素对腺苷提取率的影响，结果如图4,6。 图4 Y=f(X1,X2)的响应面及等高线图(略) 图5 Y=f(X1,X2)的响应面及等高线图(略) 图6 Y=f(X1,X2)的响应面及等高线图(略) 从响应面的最高点和等高线可以看出在所选的范围内存在极值，响应面的最高点同时也是等值线中的最小椭圆的中心点。图4表明在所选范围内，X1取不同的编码值时X2对Y的影响表现出不同的 规律 ，同样，X2取不同的编码值时X1对Y的影响规律也呈一定的变化趋势。从单个因素对Y值的影响来看，X2的影响显著性要大于X1。从图5可以看出，X1，X3的交互作用并不显著，它们对Y值的影响规律并不会随着另一因素的改变而有明显变化。图6中X2，X3也表现出与图5相似的规律。综合各图，3个因素对Y值的影响以及各因素之间的交互影响与回归分析结果吻合。SAS工具箱给出了能够得到最大响应值(Y)的X1，X2，X3对应的编码值X1=-0.321，X2=0.414，X3=-0.219。即在提取 时间为2.3 h，提取温度为44?，料水比1?38时提取率有最大值1.42 mg/g。 2.3 验证实验为了检验模型预测的准确性，按最佳提取条件提取，实验重复3次进行。结果3个平行的提取率分别为1.48，1.45，1.39 mg/g，平均值为1.44 mg/g，与理论预测值相比相对误差为1.31%，可见该模型能较好地模拟 和预测实验提取率。 3 结论 本实验通过单因素实验对影响蛹虫草菌丝体腺苷提取的主要因素提取时间、水料比、提取温度进行了探索，选取中心组合实验的范围和水平，应用响应面分析法对各因素的最佳水平范围及其交互作用进行了研究和探讨，建立了影响腺苷提取率的二次多项数学模型，依据回归分析结果，蛹虫草菌丝体腺苷水提的最佳工艺条件为:提取温度44?，提取时间2.3 h，料水比1:38。在此条件下，实际提取率1.44 mg/g，与理论预测值1.42 mg/g相比相对误差为1.31%。实验结果证明，采用响应面分析法优化蛹虫草菌丝体腺苷的水提工艺， 准确可靠，具有实际应用价值。 【 参考 文献 】 ,1, Kirk PM, Cannon P F, David J C, et al.Dictionary of Fungi.9 th ed.Wallingford Oxon: CAB International.2001:1. ,2, 孙科峰, 石 伟, 刘 丽，等.辽宁中医杂志,J,.2004, 31 (6): 520. ,3, Wu Z L, Wang X X, ChengW Y.Cell Biochem Funct ,J,.2000， 18:93. ,4, Nan J X, Park E J, Yang B K, et al. 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