[doc格式] 益肾活血胶囊对载脂蛋白E基因敲除小鼠CD40及MMP9表达的影响

[doc] 益肾活血胶囊对载脂蛋白E基因敲除小鼠CD40及MMP9表达的影响 益肾活血胶囊对载脂蛋白E基因敲除小鼠 CD40及MMP9表达的影响 ? 1044?CHINESEJOURNALOFINTEGRATIVEMEDICINEONCARDI O一/CEREBROVAsCUIARDISEASESeptember2009Vot.7No.9 基础匡学论着研窕 益肾活血胶囊对载脂蛋白E基因敲除 小鼠CD40及MMP9表达的影响D 刘桂林,张继东,戴伟,壬博,刘粉叶,任敏 摘要:目的探讨益肾活血胶囊对动脉粥样硬化免疫炎症因子的调节作用.方法apoE—KO小鼠给予高脂饮食喂养.小鼠 2O周龄时随机分为模型组,益肾活血胶囊小剂量组(小剂量组)和益肾活血胶囊大剂量组(大剂量组),小剂量组给予益肾活血胶囊 500mg/(kg?d),大剂量组给予益肾活血胶囊2500mg/(kg?d),模型组给予生理盐水0.2mL/d,于给药l2周末处死各组试验鼠. 应用ELISA法测定血清氧化低密度脂蛋白(oxLDL)含量,免疫组化检测主动脉白细胞分化抗原40(CD40);基质金属蛋白酶9 (MMP9)的蛋白表达,荧光实时定量RT—PCR检测CD40,MMP9的mRNA表达情况.结果小剂量组及大剂量组oxLDL明显低 于模型组(P<0.Ol或P<0.001),CD40,MMP9的表达降低,大剂量 组与小剂量组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论益肾 活血胶囊可下调动脉粥样硬化小鼠oxLDL,CD40及MMP9的水平, 对动脉粥样硬化具有一定免疫调节作用. 关键词:益肾活血胶囊;动脉粥样硬化;氧化低密度脂蛋白;白细胞分 化抗原;基质金属蛋白酶9 中图分类号:R541.4R285.5文献标识码:A文章编 号:l672—1349(2009)09—1044一O3 EffectofYishenhuoxueCapsuleonCD40andMMP——9ExpressioninApo E—knockoutMice LiuGuilin,ZhangJidong,DaiWei,Pf口Z DepartmentofTraditiona1ChineseMedicine,QiluHospitalAffiliatedtoShandongUniversity(Jinan250012) Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofYishenhuoxuecapsuleontheexpressionofimmuneinflammatoryfactorsinath— eroscleroticmice.MethodsApolipoproteinE—knockout(apoE—K0)mice werefedwithhighfatdiet.At20weeksofage,mice weredividedintothreegroups:Modelgroupgiven0.2mLnormalsodiumdaily,Yishenhuoxuecapsule1owdosegroup(1owdose group)andYishenhuoxuecapsulehighdosegroup(highdosegroup).Yishenhu0xuecapsulewereorallyadministereddailyat500 mg/kgand2500mg/kgrespectivelyinlowdoseandhighdosegroup.Afteradministeredfor12weeks,miceweresacrificed.Serum oxidizedlowdensitylipoprotein(oxLDL)wereexaminedbyELISA.Theexpressionofcelldifferentiationantigen40(CD4O)andma— trixmeta1loproteinase9(MMP9)inaortaswereexaminedbyimmunohistoc PCR.ResultsThelevelsof hemistryandreal_timeRT— serumoxLDLinYishenhuoxuecapsulegroupswerelowerthanthatinmodelgroup(P<0.01orP<0.001).TheexpressionofCD40 andMMP9ofaortasweredecreasedinYishenhuoxuecapsulegroups.Thelevelsinhighdosegroupwerelowerthanthatinlowdose group(P<O.05).ConclusionYishenhuoxuecapsulecouldpreventatherosclerosisbyloweringserumoxLDL,down—regulatingthe expressionofCD40andMMP一9inather0scleroticmice. Keywords:Yishenhuoxuecapsule;atherosclerosis;oxidizedlowdensitylipoprotein;celldifferentiationantigen40;matrixmetallo— proteinase——9 免疫反应在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生和发 展中起着不可忽视的作用].多种免疫细胞和分子相互协同, 相互影响,共同促进AS的发生发展氧化型低密度脂蛋白 (oxidizedlowdensitylipoprotein,oxLDL)是动脉粥样硬化发病 过程中的重要抗原物质r2],并且自细胞分化抗原40(celldiffer— entiationantigen,CD40)信号系统参与了oxLDL引起的免疫应 答过程口].AS的方法.本研究观察益肾活血胶囊,对动脉粥样 硬化小鼠oxLDL,CD40及基质金属蛋白酶9(matrixmetallo— proteinase,MMP9)表达的影响,现报道如下. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1实验动物与药物8周龄雄性载脂蛋白E基因敲除 (ApolipoproteinE—knockout,apoE—KO)小鼠24只,SPF级, 品系背景C57BL/6J,购自北京大学医学部实验动物中心,动物 质量合格证SCXK(京)2006—0008.益肾活血胶囊由山东大学 1)为国家自然科学基金资助项目(No.30572452) 齐鲁医院制剂室提供.药物组成:枸杞子15g,丹参30g,生黄 芪15g,黄精15g,川芎10g,水蛭6g,瓜蒌皮20g,大黄6g,黄 连3g.以上生药材经过二次干燥之后,按处方比例混匀,用蒸 馏水浸渍1h;然后煎煮两次,每次1h;将过滤后的滤出液混合 并浓缩,在6O?真空干燥机中制成千粉.4?保存,使用前用蒸 馏水稀释为实验所需浓度. 1.1.2仪器与试剂主要仪器:OlympusBX51型显微镜 (OlympusCorporation,Japan);OlympusDP71摄像仪(Olympus Corporation,Japan);ImageProPlus5.0数字图像分析系统 (MediaCybernetics,USA);Tgradient96型PCR热循环仪 (WhatmanBiometra,Germany);LightCycler型荧光实时定量 PCR系统(RocheDiagnostics,Germany);LEICACM1900型 冰冻切片机(LEICA,Germany).主要试剂:oxLDLELISA测 定试剂盒购自UscnLifeScience~TechnologyCompany,USA; 兔抗小鼠CD40,MMP9多克隆抗体购自Abcam,UK;免疫组化 中西医结合心脑血管病杂志2009年9月第7卷第9期 试剂盒购自晶美生物工程有限公司;Trizol,OligodT和dNTP 购自Invitrogen公司;M—MLV购自Promega公司;荧光实时 定量PCR试剂盒(SYBRPremixExTaqTM)购自Takara公 司. 1.2方法 l_2.1实验分组及给药apoE—KO小鼠给予高脂饮食喂养 (15脂肪,0.25胆固醇,84.75基础饲料,饲料经钴6O灭菌 处理).12周后,小鼠随机分为模型组,益肾活血胶囊小剂量组 (小剂量组)和益肾活血胶囊大剂量组(大剂量组),每组8只. 小剂量组和大剂量组分别给予益肾活血胶囊0.5g/,2.5 g/灌胃,1次/日;模型组给予生理盐水0.2n灌胃,1次/日;灌 胃时间为12周. 1.2.2病理形态学观察末次给药后小鼠禁食12h,不禁水, 1O水合氯醛0.04mL/10g腹腔注射麻醉.用PBS从左心室 逆行灌注主动脉后,取出主动脉弓,以4多聚甲醛固定,OCT 包埋,6m连续冰冻切片,每张切片上3个组织面,苏木素一伊 红(HE)染色后于光镜下观察.胸主动脉于一8O?保存. 1.2.3血清oxLDL检测小鼠麻醉后摘眼球取血1mL,4? 3000r/rain离心l5min,分离血清.采用ELISA法测定血清 oxLDI浓度.操作按说明书进行. 1.2.4CD40及MMP9免疫组织化学染色冰冻切片入PBS 中湿润10min,3%H202室温孵育10min,PBS洗3minx3 次,滴加1O正常羊血清封闭液,室温孵育20min,甩干,滴加 兔抗小鼠CD40,MMP9多克隆抗体,4?过夜.PBS洗涤3 rain,滴加HRP标记的羊抗兔IgG,室温30min.PBS洗涤3 rain,DAB镜下显色.采用OlympusBX51型显微镜,Olympus DP71摄像仪及ImageProPlus5.0数字图像分析系统进行图 像采集及分析. 1.2.5荧光实时定量RT—PCR检测CD40,MMP9的tuRNA 含量取约1em冻存的胸主动脉,按Trizol试剂说明书提取组 织总RNA,用OligodT,dNTP和M—MLV在PCR热循环仪上 将RNA反转录为cDNA.采用Livakc报道的2方法对 CD4O,MMP9的mRNA表达进行相对定量分析,CD4O,MMP9 的扩增倍数用比正常野生型C57BL/6J小鼠基因扩增的增高倍 数表示. 1.3统计学处理实验数据以均数?差(j士s)表示,组间 差异采用one—wayANOVA分析和q检验.所有数据资料均 使用SPSS11.5软件处理,以P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1血清oxLDL含量变化与模型组(16.06ug/mL)相比, 中药治疗后明显降低apoE—KO小鼠血清oxLDL含量,大剂量 组优于小剂量组(9.73ng/mLVS3.91ng/mL,P<0.01). 2.2组织形态学变化HE染色示模型组血管壁内膜增厚,管 腔狭窄,可见大的粥样斑块,斑块内有大的脂质核心和巨噬细 胞,泡沫细胞浸润.中药组血管壁内膜亦增厚,可见粥样斑块形 成,但管腔狭窄程度明显较模型组减轻,斑块较小.中药大剂量 组优于小剂量组. 2.3免疫组织化学CD40,MMP9表达模型组可见斑块内有 明显CD40,MMP9表达,以内皮和斑块肩部为主.中药干预后 CD40,MMP9的表达降低,大剂量组优于小剂量组.CD40, MMP9阳性表达面积占斑块面积百分比:模型组(22.88? 6.41),(36.37?8.17);小剂量组(10.61?3.22),(28.12? 3.20);大剂量组(6.33?3.02),(22.41?4.72).. 2.4CD40,MMP9mRNA表达结果根据核酸扩增的S型动 力学曲线,结合溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳,判定为特异性扩 增.数据分析采用2方法].模型组CD40,MMP9的 mRNA表达分别较正常增高了5O.15(CD40),145.52(MMP9) 倍.小剂量组二者的表达分别下降至正常的33.16倍(CD40), 58.31倍(MMP9),大剂量组为l7.69倍,17.25倍,大剂量组与 小剂量组比较,差异亦有统计学意义(P<O.001). 3讨论 oxLDL是低密度脂蛋白(LDL)氧化修饰的产物,与IDI相 比,oxLDL的多不饱和脂肪酸减少,载脂蛋白B一100(ApoB—loo) 降解,脂质过氧化物,溶血卵磷脂等水平升高_5],这些理化 性质的改变使oxLDL成为一个很好的抗原,oxLDL上的多种 抗原决定簇可被抗原递呈细胞如巨噬细胞(Macrophage,MO)等 识别,从而引起级联级的特异性免疫反应,包括T细胞的活化, 细胞因子分泌,细胞毒性作用及抗体的产生等].在AS发生 发展过程中,血管内皮细胞(vasculaendothelialcells,VECs)功 能的紊乱,脂蛋白沉积到内皮间隙可导致LDL被氧化成 oxLDL,从而使oxLDL成为AS过程中重要的抗原物质.早期 研究用oxLDL免疫兔可减少4o,5O”/00AS病变发生. Fredrikson等口]用oxLDL抗原决定簇apoB一100肽链免疫 apoE—K0小鼠,可减少6O的AS病变形成l7].在本研究中, 益肾活血胶囊可明显降低apoE—K0小鼠血清oxLDL含量,同 时也减轻了AS斑块的发展.其机制可能与益肾活血胶囊具有 明显的抗氧化,保护血管内皮作用有关L8]. CD40属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,CD40与其配体 (cD4Oligand,cD4OL)的相互作用是免疫细胞间信号转导的重 要途径.体内外的研究表明AS斑块_3及培养的人VECs,血管 平滑肌细胞(VSMCs)[103均可表达CD40,CD40L,并且oxLDL 可促进CD40,CD40L的表达[3,103.CD40一CD40I可诱导 VECs,M,VSMCs表达黏附分子如血管细胞黏附分子一1,细胞 间黏附分子一1及E一选择素等,诱使免疫成分细胞黏附到血管 壁l1].CD40一CD40L信号系统还可以促进VSECs,T细胞 表达和释放化学因子_1.在本研究中,模型组CD40有明显的 表达,这与以往的研究相符,中药干预组CD40的基因及蛋白表 达降低,尤以大剂量组明显,这可能与益肾活血胶囊降低 oxLDL的水平有关. Xu等’研究表明oxLDL,CD40均可促进VSMcs表达 MMP9,MMP9可破坏细胞外基质,促进斑块向不稳定方向发 展.本研究发现,中药干预组抑制了MMP9的mRNA及蛋白 表达,以大剂量组效果显着.益肾活血胶囊抑制MMP9表达的 作用与其下调oxLDL,CD40的水平有关. 益肾活血胶囊可降低apoE—KO小鼠血清oxLDL,下调主 动脉CD40,MMP9的基因及蛋白表达,益肾活血胶囊对As具 有一定的免疫调节作用. 参考文献: [1]WickG,KnoflachM,XuQ.Autoimmuneandinflammatorymecha— nismsinatherosclerosis[J].AnnuRevlmmunol,2004,22:361— 403.f [2]周浩.动脉粥样硬化免疫机制的研究进展[J].南华大学医学 ?1046?CHINESEJOURNALOFINTEGRATIVEMEDICINEONCARD IO一/CEREBROVASCULARDISEASESeptember2009Vo1.7No.9 [3] [41 E5] [6] 1-71 [8] [9] [1O] 版,2007,35(5):784—788. HakkinenT,KarkolaK,Yla—HerttualaS.Macrophages,smooth musclecells.endothelialcells.andT—cellsexpressCD40and CD40Linfattystreaksandmoreadvancedhumanather0scler0tic lesions:Colocalizationwithepitopesofoxidizedlow—densitylipo— protein,scavengerreceptor,andCD16(FeTR?)[J].Virchows, 2000,437:396—405. LivakKJ,Schmittgen.Analysisofrelativegeneexpressiondata usingreal—timequantitativePCRandthe2一?0method[J]. Methods,2001,25:402—408. 夏敏.氧化应激与动脉粥样硬化[J].国外医学:内科学分册,2001, 28(8):323—326. LeeTS,YanHC,PanCC,eta1.Theroleofinterleukin12inthe developmentofatherosclerosisinapoE—deficientmice[J].Arterio— scler,ThrombVasBio1,1999,19:734—742. FredriksonGN,SbderbergI,LindholmM,eta1.Inhibitionofather— osclerosisinapoE——nullmicebyimmunizationwithapoB——100 peptidesequences[J].ArteriosclerThrombVaseBiol,2003,23: 879—884. 杨瑞雪,张继东,罗玮敏,等.益肾活血胶囊对同型半胱氨酸血症实 验大鼠的影响[J1.山东大学(医学版),2006,44(1):98—101. 杨瑞雪,张继东,罗玮敏,等.益肾活血胶囊对不稳定型心绞痛患者 Hey及ET,TNF—a,NO的影响[J].上海中医药杂志,2006,40 (1):22—24. ScbOnbeckU,GerdeaN,VaroN,eta1.Oxidizedlow—densitylip oproteinaugmentsand3一hydroxy AreductaseinhibitorslimitCD40and 3一methylglutarylcoenzyme CD40Lexpressioninhuman vascularcells[J].Circulation,2002,106:2888—2893. [11]CybulskyMI,IiyamaK,LiH,ela1.AmajorroleforVCAM一1, butnotICAM一1,inearlyather0scler0sis[J].JClinInvest,2001, 107:1255—1262. [12]KotowiczK,DixonGL,KleinNJ,eta1.Biologicalfunctionof CD40onhumanendothelialcells:CostimulationwithCD40lig— andandinterleukin一4selectivelyinducesexpressionofvascular celladhesionmolecule一1andP—selectinresultinginpreferential adhesionoflymphoeytes[J].Immunology,2000,100:441—448. [13]ReindersME,ShoM,RobertsonSW,eta1.Proangiogeniefunction ofCD40ligand—CD40interactions[J].JImmunol,2003,171: 1534,1541. [14]XuxP,MeiselSR,OngJM,eta1.Oxidizedlow—densitylipopro— teinregulatesmatrixmetallopmteinase一9anditstissueinhibitor derivedmacrophages[J].Circulation,1999, inhumanmonocyte— 998. 99:993— [15]Sch6nbeckU,MachF,SukhovaGK,eta1.Regulationofmatrix metalloproteinaseexpressioninhumanvascularsmoothmuscle cellsbyTlymphocytes:AroleforCD40signalinginplaquerup— ture[J].CirculationResearch,1997,81:448—454. 作者简介:刘桂林(1972一),女,主治医师,为山东大学齐鲁医院博士研 究生,现工作于山东省医学科学院附属医院(邮编:250012);张继东(通 讯作者),王博,任敏,工作于山东大学齐鲁医院(邮编:250012);戴伟,工 作于山东省医学科学院附属医院;刘粉叶,工作于山东省立医院. (收稿日期:2009—02—23) (本文编辑王雅洁) 参七黄稳斑胶囊对兔动脉粥样斑块的干预作用 万新红,郭洪波,罗玉梅,陈朝霞 摘要:目的探讨参七黄稳斑胶囊降脂和抑制炎性因子以防治动脉粥样硬化(As)的作用.方法球囊拉伤加高脂饮食造AS 兔模型后,分为不稳定斑块对照组(A组),参七黄稳斑胶囊治疗组(B组),辛伐他汀治疗组(C组),B组,c组以药物干预,12周,24 周检测血脂及血清中血管间细胞黏附分子,1(VCAM一1),细胞间 细胞黏附分子一1(ICAM一1)和超敏C反应蛋白(hs—CRP)的浓 度(酶法).结果B组,c组血脂,血清VCAM一1,ICAM一1和hs—CRP 的浓度较A组显着降低(P<0.001),且B组优于C组 (P<0.05).结论参七黄稳斑胶囊有较好的降脂及抑制炎症反应的作 用. 关键词:参七黄稳斑胶囊;动脉粥样硬化斑块;血脂;黏附分子;高敏c 反应蛋白 中图分类号:R541.4R285.5文献标识码:A文章编 号:1672—1349(2009)09—1046—02 EffectsofShenqihuangWenbanCapsuleforPreventionandTreatmentofAtheroscleroticPlaqueinRabbits WanXinhong,GuoHongbo,LuoYamei,etai//People’sHospitalofLonggang,Shenzhen(Shenzhen518172) Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofShenqihuangWenbancapsuleforpreventionandtreatmentofather0sclerotic plaque.MethodsAtherosclerosisplaquesrabbitmodelsestablishedbyballoon—inducedabdomina1aortawalljnjuryandadietofhigh cholesterolweredividedinto3group:Instabilitygroup(groupA),ShenqihuangWenbancapsulegroup(groupB)treatedwithShenqi— huangWenbancapsuleandsimvastatingroup(groupC)treatedwithsimvastatin.Theconcentrationofvascularcellularadhesionmol— ecule一1(VCAM一1),intercellularcellularadhesionmolecule一 1(ICAM一1),highsensitivityCreactionprotein(hs—CRP)and bloodlipidweretestedon12thand24thweek.ResultsComparedwithgroupA,theconcentrationofVCAM一1.ICAM一1,hs—CRP, bloodlipidinthegroupBandthegroupCwerereduced(P<O.001).TheeffectsingroupBweresuperiortogroupC(P<0.05). ConcisionShenqihuangWenhancapsulecoulddecreasedbloodlipidandinhibitedinflammatoryfactors. Keywords:Shenqihu~ngWenbancapsule;atheroscleroticplaque;bloodlipid;adhesionmolecule;highsensitivityCreactionprotein 1)为2007年广东省深圳市龙岗区科技基金项目(No.YW2007024)