[doc] 赤芍总甙对氯化钾及N—甲基—D—门冬氨酸诱导的PC12细胞钙超载损伤的保护作用

[doc] 赤芍总甙对氯化钾及N—甲基—D—门冬氨酸诱导的PC12细胞钙超载损伤的保护作用 赤芍总甙对氯化钾及N—甲基—D—门冬氨酸诱导的PC12细胞钙超载损伤的保护作用 芍总甙对Pl2细胞钙超载损伤的保护作用及其机制方法采用组织培养法,以 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆株PCl2细胞为材料,制备KCI及NMI)A诱导的钙超载损伤模型 结果形态学检查发现赤芍总甙对两种不同类型的钙超载损伤模型中PCl2细胞均具有明显保 护作用,MTT法活细胞测定提示赤芍总甙可显着提高损伤模型中PCl2细胞存活数,减少胞内乳 酸脱氢酶渗漏,并显着减少胞内钙离子浓度结论赤芍总甙对钙超载所致PCl2细胞损伤有显 着的保护作用, 关键词赤芍总甙PCl2细胞钙超载氯化钾一甲基一D一门冬氨酸 中图分类号R914 缺血性神经细胞损伤与胞内过高的钙离子水平 密切相火,胞内钙超载导致神经细胞死亡,钙通道 阻滞剂通过抑制钙内流,在治疗缺血性脑血管病中 发挥着重要作用.文献报道赤芍提取物及芍药甙在 钻诱发的局灶性癫痫中对海马CA1区神经原损伤 有明显保护作用】,赤芍提取物可改善东莨菪碱所 致小鼠学习记忆障碍,并增强大鼠学习能力].我们 研究发现赤芍总甙埘小鼠学习记忆能力显着改善 b] ,对小鼠脑缺血再灌注损伤有较好保护HJ.本实验 中我们通过建立药物诱导的两种不同类型的细胞钙 超载损伤模型,观察赤芍总甙对大鼠PC12细胞损 伤的保护作用,并对其作用机理进行仞步研究. l材料 1.1药品与试剂赤芍总甙(TPG),白芍总甙 (FGP)由本所药物化学研究室制备,使用前,先用 60%乙醇溶解为20mg?ml一,再用双蒸水配制浓 度为2mg?ml’.氯酯醒(MEC),上海淮海制药 』’,批号:970702,双蒸水溶解.上述药物除菌过滤, 4?冰箱保存.1640培养基,一甲基一D一门冬氨酸 (N—methyl—D—aspartate,NMDA),MTT[3一(4,5一 dimethythiazol—Z—y1)一2,5一diphenytetrazoliumbro— n1ide1.Sigma公司产品.胎牛血清,杭州四季青生 物有限公司产品.十二烷基硫酸钠(SDS)购自上海 化学试剂采购供应站.钙离子及乳酸脱氢酶(LDH) 2000—03—20收稿.2000—04—10修回 何丽娜,女,43岁,副研究员,研究药物作用的分子生物学机制及医 学病毒学等 测试盒,南京建成生物工程研究所产品 1.2细胞大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆株PCl2 细胞,引自武汉大学菌种保藏中心,本研究室传代 保存. 1.3细胞培养液1640培养液,内含20%胎牛血 清,100U?ml青霉素,100g?ml链霉素,pH 7.2. 2方法 2.1KC1损伤模型的建立加入含200mmol? LKCl和2%聚乙二醇400的1640培养液于 PC12细胞上10rain,造成KC1损伤模型 2.2NMDA损伤模型的建立用含300/~mol? LMDA和2%聚乙二醇400的1640培养液于 PC12细胞上作用90rain,造成NMDA损伤模型. 2.3药物的保护实验将1×1?mlPC12细 胞接种于96孔细胞培养板,37?,5%C温箱孵 育24h后,进行药物保护实验.于损伤实验前1h 及损伤过程中加入不同浓度药液.造型后,换成正 常1640培养液,37?,5%C温箱中继续培养6 h,测定结果. 2.4观察指标 2.4.i细胞形态学观察采用倒置显微镜观察 PC12细胞生长及病变情况. 2.4.2MTT检测于培养结束前4h加入5 mg?mlMTT101/孑L,待形成蓝紫色甲月赞颗 粒后,加入10%SDS,37?过夜,使细胞彻底裂解, 酶联检测仪波长570nm下测定OD值. ,1009250】(‘N34】二c)6KL}J[}{7f7约1lJ.j(,}]l?. fjl|】f,hIII_l }cIIlaIIImI’ aillh,,l11I1III,,,,,,chimi…f【,【1,11p~i-ill({lL 2.4.3LI)H测定细胞匕释放久量II)H.』 清液中LI)H水平代表培养细胞的损伤程瞍取培 养上清,酶联检测仪波K440llnl处测()I)值,计算 lI)H含量 2.4.4细胞内(,浓度测定收集实验细胞,一20 ,反复冻融3次,测定胞『人Ja:一浓度,酶联检测仪 波K6301]111处测定OI)值,计算目色!内钙含量 2.5统计学处理教以=夫,J,怆 3结果 3.1细胞形态学观察IL,l二刑胞形,炎似 丁淋巴细胞贴壁快,长速瞍快,培养24I细lj乜分 布均匀,3d后细胞簇状牛K细目色』拟伤,’先 肿张,折度减划,随陬【缩脱落受药物保护的细 胞,形态尢ff』J改变,I 圈1I(,12细胞钙超载损伤不同阶段形态学变化表现 A:正常对照;l{:细胞损伤初期;CPCI2细胞严重损伤及死亡;D赤芍总甙对P(,12细胞损伤的保护 3.2赤芍总甙对t<(21诱导PC12细胞损伤的保护g?m1-.浓度范围内,均能保护细胞,抵抗KC1引 作用200mmol?II.KC1诱导PC12细胞损伤起的细胞钙超载损伤,提高活细胞数,减低胞浆内 后,细胞存活量显着降低,培养液中LDH漏出增LDH渗漏,降低胞内钙浓度.结果见表l. 多,细胞内钙离子含量增高.赤芍总甙在l2.5,200 表1赤芍总甙对KC1诱导PC12细胞钙超载损伤的保护作用4-s,8) 与对照组比较P<0叭;与模型组比较P<0.01 SSN100q25OIL,N34I206】【}】I{临_术约:清j’学L,lliIIJL,hI1lhal?III~LCL)ll’hcI?!15( E1l1l11cdiloImailal1ul1pl1?.tCII:,uchiI1al11fogoxOil/p?(,dlcal 3.3赤芍总甙对NMI)A诱导PC12细胞损伤的 保护作用300…)I.LNMI)A作用了PC12 细?.细死I,ljjj增j儿1刹量乔芍总组对 NMI)A诱导的细胞病变表现出不同程度的抑制作 用,提示其具有拮抗NMI)A诱导的神经细胞损害 作用,结果见表2. 表赤芍总甙对NMI).诱导IL,1细胞钙超载损伤的保护作用(?8,11=8) 与对照组比较一P<00I:与模型组比较一P<00 4讨论 实验采用两种神经细胞损伤均属于药物诱导的 细胞钙超载损伤模型.过量KCI可使细胞去极化, 开放电压依赖性钙通道(VI)C)引起细胞内钙超载; NMI)A通过作用于突触后神经原的相应受体,激活 受体?控性钙通道(RGC)引起胞内钙超载.胞内钙 超载继发性引起线粒体中毒,细胞能量代谢障碍;胞 膜磷脂酶激活,产生大量花生四烯酸(AA)类游 离脂肪酸(FAA),通过还氧酶和脂氧酶途径合成大 量如前列腺素,血栓素,脂质过氧化物及自由基代谢 产物;核酸酶,蛋白酶激活,蛋白质及核酸等大分子 物质降解;内源性兴奋性氨基酸(EAA)释放,加重 神经毒性】.实验发现赤芍总甙对上述胞内钙超载 所致神经细胞损伤具有显着的拮抗作用,活细胞 MT’I,测定和上清液中LDH检测提示:赤芍总甙 l2.5,200ug?ml均有显着拮抗KCl型及NM— I)A型钙超载损伤,并显着降低细胞内钙离子浓度, 但药物组间量效关系不显着.与对照药物白芍总甙 和氯酯醒相比,赤芍总甙保护作用亦无明显差异.细 胞钙通道受刺激后开放,导致Ca2一内流,引起钙超 载,同时激活诱导型一氧化氮合成酶产生O,进一 步加重细胞损伤.有报道芍药有效成分可抗大鼠心 脏缺血再灌注损伤,并具有抗脂质过氧化作用|6].我 们前期的研究也证实赤芍总甙对大鼠皮层神经细胞 缺氧,缺糖,氧自由基及NO神经毒性等损伤有显 着保护作用….这说明赤芍总甙除直接发挥抑制细 胞内钙超载作用外,其保护作用可能涉及其它多方 面的作用. 参考文献 lTsudaT,SugayaA,OhguchiH,eta1.Irotective effectsofpeonyrootextractanditscomponentson neurondamageinthehipocampusinducedbythe cobaltfocusepilepsymode1.ExpNeuro1.1997:146 (2):58 2楚正绪,沈洪兴,竺青,等.赤芍提取物改善学习记忆的 作用.第二军医大学,l991;12(5):465 3杨军,王静,刘超,等赤芍总甙对小鼠学习记忆能力的 改善作用.中国药理学通报,2000;16(1):47 4杨军,王静,刘超,等.赤芍总甙对小鼠脑缺血再灌注损 伤的保护作用.中药材,2000;23(2):98 5PedataF,LaminiS,PuglisesAM,eta1.Investiga— tionsintotheadenosineoutflowfromhippocampaI slicesevokedbyischemia—likeconditions.JNeu— rochem,1994;61:284 6ZhangWG,ZhangZS.Anti—ischemiareperfusiondam— ageandanti—lipidperoxidationeffectsofpaeonolinrat heart.ActaPharmaceutieasinica,1994;29(2):145 7何丽娜,杨军,何素冰,等.赤芍总甙对原代大鼠神经细 胞损伤模型的保护作用.中国临床药理学与治疗学, 2000:5(1):28 L,\341206,’R’f临】禾约,.0瀹j’.,hin.1L,l…Iln?t,1I1lr2000(二1 malledit『)rs@mailah,,hpII11L,{cI1:\,,,,,chil1【11f’’),L,I】,p~’ri『l’{IL,1 Effectoftotalpaeonyglycoside(TPG)anditsmechanism oncalciumoverloadinginjuryinculturedPCI2cells HELi—NaYANGJu11HESu—Biilg (Hiolog(‘al&M(tkinal(‘entp’alLab(.’C2tor\-f),A.hui.HeTi.f)6fj 关于申报评选2000年第4届中国药理学会Servier青年药理学工作者奖的 1获奖候选人条件中国药理学会会员;年龄在37岁(1963年7月31Et以后出生)以下;在国内从事药 理学研究并取得优秀成绩,不包括在国外做过的工作;从获奖之Et起,至少在国内工作一年以上. 2报名及评选程序符合上述条件的青年药理学工作者接到通知后,可向各地区或直辖市评选负责人 (名单列后)报名,报名截止日期为2000年7月31日(以邮戳为准).报名时需报以下资料:?个人简历,中 英文各1份;?未发表的论文各1篇,全文用中文或英文撰写均可,但摘要和图表需用英文撰写;?二位专 家(教授或相当职称者)的推荐书,并经单位同意及加盖公章;初审由全国各地负责人(或学会)组织专家对 本地区申报材料进行评审,评选出3名候选人,将其材料及本地区专家评审意见及排名顺序,于2000年8 月底前报送中国药理学会办公室(北京先农坛街一号中国药理学会赵小丹收,邮编100050);终审由中国药 理学会组织专家评审,选出10,20候选人送Servier法方专家评审.2000年9月由中法两国评委评出8名 获奖者. 3获奖颁奖时间另定,获奖者将获荣誉证书和壹万元奖金. 附:全国各地区评选负责人名单: 北京:张均田中国医学科学院药物研究所(100050);林志彬北京医科大学基础医学院药理学系 (100083);上海:王永铭上海医科大学药学院药理教研室(200032);苏定冯第二军医大学药理教研室 (200433);天津:刘昌孝国家医药管理局天津药物研究院(300193);西北:白元让西安医科大学药理教研 室(710061);西南,重庆:包定元成都华西医科大学基础医学院药理室(610041);华东:徐叔云合肥安徽 医科大学临床药理研究所(230032);中南:曾繁典武汉同济医科大学临床药理研究所(430030);东北:李 智沈阳中国医科大学药理教研室(110001);王本祥吉林省中医学院附属医院新药研究中心(130021); 华北:任雷鸣石家庄河北医科大学药理教研室(150017) , , 一一一 ,一一一一一一 ,,,一一,一一一,,.h二l?一?训,_H?一m_耋,?{兰_蚕一一,一一,,一,一,一一,一一h一一一一.,一一一一一,一一,一一,一一一,,,一一,一一,一,一,呲_兰_至抓叭删,一一,,一一一一一一, ,》 ; 息一 肖,’;.】—?,