中药方剂四物汤补血作用有效部位的研究

中药方剂四物汤补血作用有效部位的研究 山东中医药大学 博士学位论文中药方剂四物汤补血作用有效部位的研究 姓名:王玉华 申请学位级别:博士 专业:中药学 指导教师:袁久荣 20040420 提要 目的在四物汤已有的研究结果基础上，确定四物汤全方的补血有效部位。对“有效部位”建立完整的质量控制体系，并进行补血作用机理研究。方法立足于四物汤全方，将全方的成分分离为三个大的有关部位。研究过程将中药化学、中药质量控制以及药理学学科紧密结合。通过血清药理学、血清药化学和药代动力学实验，对四物汤补血作用机理进行研究。成果完成了,,,超临界萃取部位、醇提部位以及多糖部位的分离、分析;建立了与四物汤治疗血虚证的血象特点相对应的血虚模型;确定了四物汤补血有效部位;对有效部位建立了完整的质量控制体系，并进行了指纹图谱研究:对有效部位开展了血清药化学、血清药理学和药代动力学研究。结论本文确定了四物汤的补血有效部位，其化学成分主要包括多糖、苷类、有机酸类和生物碱类。有效部位的质量标准为确保用药的有效性提供了依据。血清药化学实验确定了阿魏酸是有效成分之一。血清药理学研究结果表明，四物汤及其有效部位均可以显著促进骨髓细胞的分化和增殖。药代动力学参数为临床用药提供了依据。 关键词 四物汤;有效部位:,,,,;指纹图谱;补血作用 束经作黄、导师碲鞭 钿垒文公柱 ,,,,, ,, ,,, ,,,,;,,,, ,,,,, ,,,,;,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,,,,,,,,,,,,(,,,),,,;,,,,,,: ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,;,,,,,,,: ,,,, ,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,, ,,,, ,,,—,,,, ,,,,,,;, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,，,,, ,,,,, ,,, ,,,,, ,,, ,,,,;,,,,,,,;,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,;,,,, ,,,,, ,;,,,,(,,, ,, ;,,,,,,, ？,,,,,, ;,,,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,;,,,,(,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,;,,,,,, ,, ,,,,;,,,, 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本课题的前期研究完成了四物汤拆方配伍及各配伍组方不同极性部分的成分分析和药理药效学研究，得出结论:补血药效以四物汤全方最好。本论文立足于四物汤全方，把握补益剂的特点，认为其药效一定是多成分的综合作用，提取分离有效部位中严格把握有关部位的提取分离和净化环节，减少化学成分的损失。在研究过程中，将中药化学、质量控制以及药理学学科紧密结合，有效部位的提取分离过程在药理药效学实验和化学成分分析跟踪指导下进行，摆脱以往盲目进行分离的研究方法。对确定的有效部位开展血清药化学和血清药理学研究，为进一步对中药方剂的药效物质基础进行研究奠定实验方法学基础。对有效部位进行药代 动力学研究为指导临床用药提供依据。在实验中模拟临床血虚证患者的皿象建立血虚模型，使中药方剂四物汤的药效学评估体系立足于中医药理论，且符合中医用药特点。在质量标准的研究中包含一定数量的指纹图谱的研究内容以充分体现国际惯例的要求。本文为中药方剂的现代化研究提供实验依据和方法学思路。 山东中医药大学,,,,届博士学位论文 第一部分文献综述 一、中药方剂四物汤研究综述 四物汤渊源于《仙授理伤续断秘方》川，是补血与活血兼顾的代表方剂。方中熟地黄滋阴补血为主药;辅以当归补血养肝，和血调经;白芍和营养肝;川芎活血行滞。四药配伍，地黄、芍药均能滋阴养血，为补血之正药;当归、川，芎辛香温润，既能流动血脉，且又能制约地黄、白芍纯阴之性，为血中之气药。因此，血虚能补，血燥能润，血溢能止，血滞能行，乃补中有通，补而不滞之剂。四物汤在临床上广泛应用，为补血、活血、调经之良方。近年来，国内外学者应用现代科学方法对四物汤进行了多方面的实验研究，研究涉及化学成分研究、药理作用研究、补血作用机理研究、药代动力学研究等。本文将,,,,年至,,,,年间的文献研究概述如下，为补血要剂四物汤的进一步研究奠定基础。,化学研究方面 四物汤做为补血要剂，起作用的是复方中的物质群，其实质是若干个化学成分的集合，四物汤化学成分的分析和研究是揭示其作用实质的重要组成部分。袁久荣等„,〕,,,,,】采用现代仪器测定了四物汤中化学成分、微量元素、氨基酸以及水溶性煎出物，并对单味药煎液、群煎液和分煎混合液的测定结果进行了比较。之后从中医用药的整 ”体观念出发，着眼于中药及复方物质内部化学成分的总体宏观效应，遵照“相似相溶和“混合物各成分的紫外光谱具有叠加性”的原理,,,，对四物汤各拆方配伍的紫外谱线组图谱进行了测试比较，从宏观上观察了各拆方配伍的化学成分变化，并结合有关药理笛椋 教至怂奈锾琅湮榛 啤,萑氐冗牛贰俊玻浮垦芯苛怂奈锾琅湮槎杂行С煞稚忠?铡 ?核峒宄隽康挠跋欤 佣 辛烁鞯ッ烈?湮樽榉揭?П浠 奈镏述膛 难芯浚 倍云溆卸境煞直郊姿岬募宄隽拷 辛丝疾欤 峁 允荆 诓煌 湮樽榉街校 奈锾赖谋郊姿峒宄隽孔畹停 髁怂奈锾琅湮橛欣 谠鲂Ъ醵尽?吕文海等【,四】研究了酒煎、水煎和酒制后水煎方法对四物汤成分溶出的影响。结果表明，以黄酒作煎时，其还原糖、总氮、磷脂、游离氨基酸、铁铜锌元素、总煎出物量、总脂溶性成分、阿魏酸和芍药苷的含量较酒制后水煎的测定结果高,,,,倍， , 中药方荆四物汤补血作用有效郜住的研究水煎兑酒之效也优于酒制水煎。郭永生等【“,研究了四物汤各药材单煎与共煎提取物进行了质量分析，结果表明，其薄层定性分析结果无明显的差异，但阿魏酸的提取量差异较大。另有报道【,,,，采用柱色谱和薄层色谱技术联用的方法，从复方四物汤口服液中分离了芍药苷，并用刮板紫外分光光度法测定了其中芍药苷的含量。李益福等〔,列对四物汤的提取工艺进行了比较研究，阿魏酸和芍药苷的含量测定结果表明，超声提取时含量最高，其次是半仿生提取法，含量最低的是水煎煮法。杜中惠【,,】对四物汤水煎煮时间进行了考察，以煎膏煎出率、还原糖和磷脂含量作为测定指标，结果显示，煎煮时间到,,,,,时，各项检测指标均达到最大值。李奇海【,,】对四物汤中的微量元素进行实验研究，结果显示，铁和锌在四物汤中的含量均较高，这和现代医学用铁化合物治疗贫血的理论一致。 舒树方等,,测定了四物汤中,,、,,、,,、,,、,,、,,、,,、,,等八种元素的含量，认为这八种元素对人体血液代谢起着重要作用，而且，,,、,,、,,、,,、,,、,,是元 素周期表中第四周期的元素，该周期的多数元素都具有不同程度的升血刺激作用。将现代医学研究成果与实验结果相结合，阐明了微量元素在四物汤补血中至关重要的作用。 综合四物汤各单药材的化学成分研究资料，四物汤中主要含有:挥发油类、多糖类、苷类、有机酸类、生物碱类、微量元素【”卜【,,,。另《中华本草》,, ,,,对单味药当归、熟地黄、白芍、川芎的研究做了较为全面的收载，内容包括来源、采集加工、药材鉴别方法、化学成分的研究、药理作用的研究、药物的性味归经、临床应用与配伍、常用附方及制剂形式等。,药理药效研究方面,(,四物汤对血液及造血系统的作用,(,(,四物汤对粒系、单核系细胞造血功能的影响 四物汤可以显著地促进正常小鼠脾淋巴细胞产生集落刺激因子(,,,,)，也能明显词激肺条件培养液中,,,,的生成。结果表明，四物汤对粒系、单核系细胞的增殖作用与其分泌,,,,有关【,射。 机体的骨髓造血机能主要受集落刺激因子(,,,,)、白细胞介素(，,)和红细胞生成素(,,,)三大类造血生长因子的调整。前两者主要是刺激粒系、单核系细胞的增殖与分化，后者只针对红系造血细胞。王碧英等【,,】通过测定血清红细胞生成素 (,,,)和脾条件培养液(,,,)中红细胞生成素样生成因子的水平，研究四物汤 山东中医药大学,,,,届博士学位论文对红系细胞补血调血的作用机理。实验结果显示，四物汤能显著地提高正常小鼠、正常和血虚大鼠血清,,,水平以及正常和血虚大鼠脾条件培养液(,,,)中,,,样生成因子水平。提示四物汤的补血调血作用机理与其刺激,,,分泌和促进,,,样生长因子的产生有关。 马增春等刚,,,,分别用,射线照射的方法和腹腔注射环磷酰胺方法制成小鼠血虚证模型。对血虚证小鼠灌胃给药四物汤并对骨髓造血粒单系祖细胞(,,,—,,)、早期和晚期红系祖细胞(,,,(,、,,,(,)、巨核系(,,,(,,,)、混合系(,,,(,,,)造血祖细胞进行了检测，实验结果显示，四物汤对血虚小鼠造血祖细胞的增殖具明显的促进作用。,(,(,四物汤对血液中的有形成分的影响 四物汤可以显著地提高血虚小鼠血象中白细胞数〔,,】(,,】、红细胞数和血红蛋白数，且升高红细胞的作用高于铁剂组【,,】【,,〕。有研究报道,,,】，四物汤可以促进铁、铜、锌的体内吸收，提示四物汤补血调经的物质基础。 青蒿琥酯是从中药青蒿中提取并经化学修饰而制成的抗疟新药，大剂量服用时可以抑制骨髓红系造血机能，血液中的网织红细胞减少。为解决防治问题，研究者对传统补血调血中药进行了实验研究和对比，结果显示，四物汤的疗效最好，“,，其中起主要作用的是阿魏酸〔,,,。,(,,,四物汤抑制血栓形成的作用 四物汤各单味药熟地黄、当归、白芍、川芎具有抗血,,,，板聚集、抗凝血酶、降低血液粘滞度、强心扩血管等作用。四物汤复方制剂的实验研究显示，四物汤不但具有明显的体外抗凝作用，且对静脉和动脉血栓形成均具有明显的抑制作用，其抗血栓形成机制可能与抗凝血、抑制血小板聚集和增加血管内皮细胞抗血栓形成能力有关„”。,(,(,四物汤可以提高血虚证患者红细胞膜,,,酶活性 血虚症患者红细胞膜的,,，、,，、,,,酶和,, ,斗、,,,，、,,,酶活性显著地低于正常对照组，同时该酶的活性与患者血虚程度密切相关。用四物汤对血虚患者治疗,周后，,,,酶活性明显提高。这一结果提示四物汤补血的机理与引起红细胞膜,,,酶活性增高有关〔,”。,(,(, 四物汤对正常动物血脂的影响 四物汤水提液和醇提液均可以明显提高大鼠及小鼠高密度脂蛋白胆固醇 , 中药方膏,四物汤补血作用有效郜 住的研宄 (,,,—;)含量，并降低低密度脂蛋白胆固醇(,,,(,)含量。实验结果提示，四物汤不仅能减少胆固醇在肠道的吸收，加速胆固醇在体内的转化，可能还增加高密度艏蛋白对由(中胆固醇的转运和低密度脂蛋白受体对,,,的摄取【,,,。,(,四物汤对免疫系统的调节作用,(,(,促进细胞产生细胞因子 四物汤和刀豆蛋自(,,,,)与小鼠脾细胞共同培养,天后，其结果显示四物汤可促进,,,,诱导的淋巴细胞增殖，增加,细胞功能，具有免疫激活作用【,,】。不同剂量的四物汤还可以促进,,,,激活脾淋巴细胞分泌细胞因子，这可能是四物汤增强机体免疫和造血机能的机制之,,,,,】,,,们。,(,(,对红细胞免疫功能的影响 用四物汤对电离损伤小鼠和血虚证家兔进行了治疗研究。实验结果表明，四物汤使红细胞,,,花环率和红细胞免疫复合物(，,)花环率均恢复到正常水平，且红细胞免疫复合物(，,)花环率高于正常对照组。提示四物汤可以使受损伤的红细胞,,,受体得到修复或使,,,受体的再生能力得到提高,,,〕【,,,。,(,?,对,细胞增殖和巨噬细胞吞噬功能的影响 有研究报道【,,】，四物汤能够使,,,,,,小鼠的胸腺和脾脏明显增重，且能够提高抗体滴度和,,,,阳性细胞的百分率，从而提示四物汤对体液免疫和细胞免疫均有显著增强作用。,(,(,对小鼠血清溶血素水平的影响 郑钦岳等口,,观察了四物汤及各单药材组分,,,，鼠衄清溶血素水平的影响，实验结果显示，四物汤中的熟地黄和当归能显著地提高小鼠血清溶血素水平，自芍和川芎可降低小鼠血清溶血素水平，但作用不显著，且四物汤中各个组分的量不同时，对小鼠血清溶血素水平的影响亦不同。提示四物汤对体液免疫的作用与四物汤中各组分的量密切相关。,(,四物汤对心血管系统的作用,(,(,四物汤增,，,脏收缩功能 用四物汤对正常大鼠灌胃给药后，观察对心脏功能的影响。结果显示，与对照组比较，左心室收缩压峰值、左心室压力上升与下降的最大速率、心内压为,,,,,,时心肌纤维收缩速度均显著增加，而平均动脉压、等容收缩压、心率等变化不显著。 山东中医药大学,,,,届博士学位论文结果提示，四物汤因可以增加心脏收缩性能，从而可增加心脏的泵血功能【,”。,(,(,四物汤改善微循环的作用 将四物汤以,,,,,,及,,,,,,剂量给小鼠灌胃时，发现可以显著扩张小鼠耳廓和肠系膜动脉，四物汤直接滴于肠系膜，也明显扩张其静脉和动脉，且可能对动脉的作用更强，并对去甲肾上腺素引起的动脉收缩效应有拮抗作用。研究中还发现，四物汤可能与妥拉苏林有协同作用。因此，四物汤改善微循环的作用与,(肾上腺素阻滞作用和它对微循环的直接作用有关【,,】。,,名健康受试者服用四物汤,天后，血管内红细胞聚集柱的最大直径明显缩小，血流率和血液容积明显提高，对全血粘度的低切应率稍有降低，但其中切应率和高切应率明显降低，但血清粘度并不改变，四物汤不通过改善红细胞聚集而降低全血粘度【,,】。,(,四物汤的抗辐射作用,(,(,四物汤对抗,射线的作用 以,,,,,,连续给药七天后，用,射线照射小鼠，四物汤可增加受照小鼠的内源性脾结节以及外周血中的红细胞、白细胞、血小板和血细胞比容冈。,(,(,四物汤对抗,射线的作用 四物汤及单味药材的研究结果显示，当归和白芍可以提高受照小鼠肠道隐窝的存活率，熟地黄、当归、白芍对内源性脾结节的产生更有效，川芎和白芍能预防射线引起的肠道隐窝细胞凋亡，四物汤对以上指标均有效，且作用最强【,,,。 胡玉霞等〔,,】研究了四物汤对接受致死剂量,射线照射小鼠的防治作用，发现在,射线照射前注射 四物汤醇提物或水提物均有较强的防护作用，而在照射后给药却无此作用。该作用与川芎有依存关系，当归和白芍对其有辅助作用。谭允育等陋,,观察了,射线照射小鼠免疫功能的改变及其四物汤对免疫功能的影响，实验结果显示，,射线照射小鼠引起体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能下降，四物汤对这种免疫功能的下降具有拮抗和纠正作用。四物汤对,射线照射小鼠的抗体产生、外周血中,、,细胞数、迟发性超敏反应、血清容菌酶含量及小鼠体重均有明显的保护作用，对胸腺指数、脾指数及巨噬细胞的吞噬功能有轻微增加作用，但作用不显著。实验结果提示，四物汤具有抗辐射损伤作用，可能与免疫调节作用有关。章亭等【,,,进一步实验证实，小剂量四物汤既可以使电离辐射对骨髓干细胞增殖分化能力的抑制作用恢复正常，而大剂量四物汤组的骨髓干细胞增殖能力甚至超出了正常对照组。 中药方膏,四物汤补血作用有效郜住的研宄,，,,四物汤对抗紫外线所致损害 四物汤外敷用药对胶原足肿胀及豚鼠紫外线红斑的急性炎症有显著抑制作用。在探讨四物汤对紫处线照射所致纫胞损伤是否有保护作用的同时，以培养的,,,,, ,,,细胞探讨了四物汤对,,,,生成作用的影响，并与对照药做了比较。结果表明，四物汤对紫外线照射所致细胞损害有保护作用，并可抑制,,,,的释放，这种抑制作用呈浓度依赖性，且认为四物汤对豚鼠紫外线红斑炎症的抑制作用与抑制,,,,的释放密切相关【,,,。,(,其它药理作用研究,(,(,抗化学药物毒性的作用 :实验研究结果显示，四物汤可以显著对抗利多卡因和氨基糖苷类药物的毒性反应【,,〕„州;对,,,,和扑热息痛所致实验性肝损伤有一定的保护作用【,,】;能抑制环磷酰胺诱导的骨髓微核细胞率增高的现象，具有良好的抗突变作用,,,,:,(,(,抗缺氧的作用 利用亚硝酸钠、异丙肾上腺素、结扎双侧颈总动脉和常压,致缺氧的方法，制各急性缺氧小鼠动物模型，对模型动物分别腹腔注射西物汤水提液和醇提液。实验结果显示，四物汤对上述原因所致的动物缺氧均有不同程度的对抗作用。四物汤抗缺氧的机理可能是通过改善血液循环，增加氧的供应以及降低肾上腺素能系统功能，这些作用是通过降低动物整体耗氧量，增加心肌细胞耐缺氧能力，提高脑组织对缺氧的耐受力以及降低脑组织耗氧量来实现的，从而使急性缺氧的动物存活时间延长【,,,。,(,(,抗自由基损伤的作用 通过使幼鼠短时间吸入臭氧(,,)，在机体内诱发较强的自由基反应导致的一系列类似衰老的机能变化，同时灌服四物汤观察其防老抗衰以及抗自由基损伤的作用。实验结果显示，四物汤能够明显改善衰老模型出现的体力下降、御寒能力和对缺氧的耐受力降低(可减弱体内脂质过氧化作用，使脂质过氧化物含量降低、脑,型单胺氧化酶(,,,,,)活力降低、血清超氧化物歧化酶(,,,)的活力升高。结果表明，四物汤具有显著的抗自由基损伤的功能，因而能够延缓衰老【, ,,。,四物汤的药代动力学研究 中药方剂药代动力学是目前比较困难的一个研究领域，其关键之处是无法解决复杂成分的血样分析。因此，有人提出并开展了以药理效应为指标进行中药方剂的药代 山东中医药大学,,,,届博士学位论文动力学研究。卢贺起等四以血小板聚集抑制率为药理效应指标，研究了四物汤的药代动力学参数，同时以中药方剂药动学研究为目的，对药理效应法研究药动学进行了比较研究。家兔灌胃给药四物汤后进行药动学研究的结果显示，四物汤符合开放一室模型，吸收半衰期和消除半衰期分别为,(,,,和,(,,，,,,,(,,,，效应维持时间为,(,,。,四物汤补血作用配伍机理研究 四物汤由熟地黄、当归、 白芍、川,芎四味药配伍组成，其配伍机理的研究报道较少〔,,】【,,】，矧，而且所做的研究内容不够深入，与中医理论有一定差距。 为了弄清楚四物汤最佳的配伍组合，即在血虚证治疗中起重要作用的组合，分别对其组成药味及全方提取物的作用进行了比较研究。实验结果显示，四物汤全方的补血作用最强，当归在方中起主要作用;在两味药配伍中，熟地黄与川芎、熟地黄与当归的作用较好;三昧药配伍中，熟地黄、当归、川芎的作用最好。分别测定四物汤全方、两味配伍及三味药配伍者的水提液中微量元素铁、铜、锌的含量。单味药提取时，铁离子含量,,)，，芎最高;两味药提取时，铁离子含量以熟地黄和川芎配伍最高。四物汤全方配伍时微量元素含量最高，推测四物汤改善贫血作用与铁离子有一定关系„, ,,。 袁久荣等„,,】对四物汤配伍机理进行了较深入的研究。用乙酰苯肼和环磷酰胺造成小鼠血虚证模型，以各组动物的血红蛋白、红细胞计数、红细胞压积、白细胞及血小板为指标，通过观察四物汤中四昧药按不同排列组合构成的,,种样本药物对此动物模型补血作用的影响，结合计算机聚类辅助分析，初步探明四物汤补血作用的配伍机理。实验结果显示，四物汤全方的补血作用最强，当归在方中起主要作用;在两昧药配伍中，当归与白芍、当归与熟地黄的作用较好;三味药配伍中，当归、白芍、川芎的作用最好。,日本关于四物汤的文献研究及临床应用,,,(,日本古典医籍中记载的四物汤 在日本，四物汤见于《医疗众方规矩》、《古今方汇》、《牛山方考》、《方读辩解》、 《蕉窗方意解》、《观聚方要补.