通过显微注射法构建ES细胞_MESPU13_嵌合小鼠

通过显微注射法构建ES细胞_MESPU13_嵌合小鼠 () () 遗传 HER ED I TAS Beijing18 1:7 —10 1996 通过显微注射法构建 ES 细胞( MESP U 13) 嵌合小鼠 ? 冼美薇 吴白燕胡新立 尚克刚 吴鹤龄 ( ) 北京大学生命科学学院 , 北京 100871 ( ) 摘 要 为了研究一个新建的小鼠胚胎干细胞系 ES 细胞系M ESPU 13 , 我们将 ES 细胞显微注射 到 C57BL / 6J 小鼠的囊胚中构建嵌合鼠 。在注射了 2 —9 个 ES 细胞的 136 个囊胚中 , 127 个囊胚 () 93 %经过 3 个小时的培养后重新出现囊胚腔 。当把 119 个恢复的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫内时 , () ( ) 获得 63 只 52 . 9 %出生鼠 。在 59 只存活到可以判断毛色阶段的小鼠中 ,有 21 只 35 . 6 %被判定为 嵌合鼠 。显示了该 ES 细胞系具有较高的嵌合能力 。 关键词 ES 细胞 ,囊胚 ,显微注射 ,嵌合小鼠 Construct ion of Chimeric Mice of ES Cell s by Microinject ion Method ? Xian Meiwei Wu Baiyan Hu Xinli Shang Kegang Wu Heling ( )College of Life Sciences , Peking U niversit y , Beijing 100871 () ES 细胞 embryo nic stem cells是胚胎性多能干细胞 ,自从 Evans 和 Kauf man 以及 Martin 分别报道了从小鼠囊〔4 ,9〕胚中成功地建立起 ES 细胞系以来,许多实验证明小鼠 ES 细胞可以在体外特定的条件下进行培养 ,在保持二 倍体状态的同时 ,具有分化成为体内各种组织细胞的潜能 。1987 年 , Tho mas 和 Capecchi 将基因定位整合技术与 〔16〕( ) ES 细胞途径相结合 , 首次获得了内源基因 Hp rt定位失活的转基因小鼠。随后 , 人们以同样的成功地定 〔19 ,20〕〔8〕〔3〕位改变了一系列的内源基因,例如 : 通过 ES 细胞对 M T 基因和对 t PA 基因的研究 ,在分子和个体水平 上使人们对这些基因有了更深的了解 。同时 , 也充分显示了 ES 细胞途径的潜力所在 。 本研究用北京大学生命科学学院所建立的 ES 细胞系 M ESPU 13 ,通过囊胚显微注射法构建 ES 细胞嵌合鼠 , 为最终通过 ES 细胞途径获得转基因小鼠进行了初步的探索 。 1 和方法 1 . 1 ES 细胞 (() ES 细胞 M ESPU13 是由 129/ Ter 以下简称 129小鼠的囊胚建立的 胡新立 , 尚克刚 ,1993 . 第三届全国动物遗 ) 传学术讨论会论文集 , 55 —56 . , 用于嵌合体制作的 M ESPU13 为第 9 代至第 13 代的细胞 。注射前 ES 细胞用 () PBS 清洗一遍 , Tryp sin - ED TA 分别为 0 . 25 %和 0 . 04 %处理 10 —30 秒钟后 ,用 ES 细胞培养基反复吹打成单细 胞悬液 ,用于囊胚的注射 。 1 . 2 小鼠胚胎的收集及培养 ( )129 小鼠具有浅栗色的毛色 ,为了便于嵌合鼠的 ,本研究选用了毛色为黑色的 C57BL / 6J 以下简称 C57 小鼠作为受体囊胚的提供者 。毛色为白色的昆明鼠作为胚胎移植时的受体动物 。两个品系的小鼠均购自北京医 ? 北京医科大学生物遗传教研室 , 北京 100083 。 ?Depart ment of Biology and Genetics , Beijing Medical U niversity , Beijing 100083 . 科大学实验动物部 。 下午 4 —5 点钟 ,将成熟的 C57 雌性小鼠与同品系的雄性小鼠合笼 ,并于次日上午挑出带有阴道栓的雌鼠即为 ( 妊娠第一天的孕鼠 。妊娠第四天上午 10 点左右 ,将孕鼠用颈部脱臼法处死 ,取出子宫 。用 Whit ten 氏培养液 以下 〔17〕) 简称 WM 液收集胚胎。移到覆盖液体石蜡的 WM 液滴中 ,在含有 5 %CO, 37 ?的培养箱中培养至显微注射 。2 1 . 3 注射针 、持胚针及移胚针的制作 () μ将外径约 1mm ,内径约 0 . 8mm 的毛细玻璃管用拉针器 leitz , German拉成细针 ,在外径 15m 左右的部位 , 切 μ出斜面的针尖 。持胚针的作法如下 : 用酒精灯加热毛细玻璃管 , 拉出一段细管 , 在外径 100 —120m 的部位 , 断成 μμ平口 , 在火焰上加工端部 , 使其内口径为 20 —30m 。移胚针的作法与持胚针的相同 ,内径为 130 —180m ,外径 μ200m 左右 。 1 . 4 ES 细胞的显微注射 在直径 10cm 的塑料培养皿中 ,用 ES 细胞的培养基作一直径约 1cm 的注射液滴 ,覆盖上液体石蜡 。用移胚针 将 ES 细胞和小鼠囊胚分别移到注射液滴中 ,用持胚针固定囊胚 ,用注射针轻轻吸入 ES 细胞 ,使针尖对准囊胚中央 ( 滋胚层细胞的邻接处 ,迅速刺入囊胚腔中 。轻轻吹出 ES 细胞使其恰好落在内细胞团上 ,小心拔出注射针 图版 I , ) 1 —3。用移胚针将胚转移到覆盖着液体石蜡的 WM 液滴中 ,于 37 ?含 5 % CO的培养箱内培养 3 小时后进行移 2 胚 。 1 . 5 胚胎移植及嵌合鼠的判定及嵌合鼠的交配 〔5〕昆明雌鼠与输精管结扎了的昆明雄鼠交配后 , 在假妊娠的第三天用 Avertin 麻醉,在腰部剪一开口 ,夹住脂 肪组织 ,将子宫拉出固定好 。在解剖镜下 , 在子宫角寻找血管分布较少的部位 ,用 4 号注射针头打一个孔 。将吸好 了胚胎的移胚针插入该孔 , 将胚胎吹入子宫腔内 。然后将子宫等组织复位 , 缝合肌层和皮肤 。移胚后受孕的假母 约在妊娠第 20 天左右自然分娩 , 2 周后可根据毛色判定其是否为嵌合鼠 。其为纯黑色的毛色来源于受体的 C57 小鼠囊胚 。若在此基础上观察到来自供体的浅栗色毛色 ,则该鼠被判定为嵌合鼠 。 胎儿出生后 4 周时离乳 ,雌雄分笼饲养 。7 周龄时 ,每一雄性嵌合鼠与 3 —4 只 C57 雌鼠合笼 。而每只雌性嵌 合鼠与 1 只雄性 C57 鼠合笼 。观察并记下产仔的日期 、数目及毛色情况 。 2 结果 2 . 1 囊胚的显微注射和恢复 ( 注射前大部分的囊胚具有膨大的囊胚腔 , 细胞轮廓分明 , 细胞间邻接也清晰可见 , 适合于显微注射 图版 I , ) 4。从 1 可以看到每次显微注射的胚胎数为 7 —8 枚 ,一共显微注射了 136 枚胚 。每枚胚接受的 ES 细胞为 2 —9 个 。注射后的囊胚逐渐收缩 , 囊胚腔变小直到最终消失 。注射后的胚在 WM 液中 , 在 37 ?, 含 5 %C0的条件下 2 () 培养 3 小时 ,其中有 127 枚胚恢复成为状态良好的囊胚 图版 I , 5 和 6, 其恢复率为 93 % 。 2 . 2 嵌合鼠的产生及毛色分析 () 选择注射后状态良好的 119 个囊胚分组移植到 11 只假孕第 3 天的昆明雌鼠的子宫里 。有 10 只 90 . 9 %雌鼠 ( ) 妊娠并分娩出 63 只小仔 , 产仔率为 52 . 9 % 表 1。其中 59 只小仔存活到可以判断毛色的阶段以后 。根据受体 C57 囊胚产生纯黑色 , 而供体 ES 细胞产生浅栗色毛色的原理 , 把小仔中呈现出浅栗色毛色的判断为 ES 细胞嵌合 () 鼠 图版 I , 7。从表 2 中可以看到 , 在 59 只存活的小仔中 , 有 21 只为嵌合小鼠 , 嵌合鼠的产生率为 35 . 6 % 。其 中雄性嵌合鼠的比率为 57 . 1 % 。根据 ES 细胞来源毛色所覆盖的小鼠体表面积的百分率计算嵌合鼠的毛色嵌合 () 率 , 可将嵌合鼠分成四个组 表 2。 ( ) 1 期冼美薇等 :通过显微注射法构建 ES 细胞 M ESPU 13嵌合小鼠9 表 1 嵌合小鼠的产生率 嵌合鼠数 表型为雄鼠数 出生小仔数 实 验 移植囊胚数 ( )( )( )占囊胚的百分率占出生小仔的百分率占嵌合鼠的百分率 1)( )( )( )12 17 10 15 654 262 501 23 ( ( ))( )2 12 3 2510 1 3313 1 100 1( ( ))( )7 4318 2 2816 3 1 5010 16 ( ( ))( )4 4010 1 2510 4 10 1 100 ( ( ( )))5 7 4 572 501 5011 10 10 ( ( ( )))6 8517 5 8313 2 4010 6 7 1)( ( ( )))7 13 4614 4 3018 3 7510 28 ( ( ( )))11 6818 2 1812 1 5010 8 6 ) 2( )( )( 21 3516 ) 12 5711 总数119 635219 ) ) 1移植进 2 只假孕雌鼠的子宫 ;2在这些小仔中 ,59 只存活到可以判断毛色的阶段。 )1 表 2 嵌合鼠的毛色嵌合率 ( )( )毛色嵌合率%嵌合鼠数%雄 性雌 性 ( )( )13 3 141 - 2 spot s 1 2 ( )7 3313 20 - 50 3 4 ( )70 - 85 2 915 2 0 ( )6 3 ?909 4219 ) 1嵌合率用来源于 ES 细胞的浅栗色被毛所占的百分率表示。 2 . 3 嵌合鼠后代的毛色分析〔1〕将成年的嵌合鼠分别与 C57 小鼠作交配实验 。C57 品系小鼠的毛色基因为 aa , BB , 。可以产生CC , DDW W 出 a , B , C , D 的精子或卵子 。ES 细胞来源于 129 小鼠 , 其毛色基因型为 A A , 〔10〕chch , 如果 ESDDBB , cc, W ch 细胞嵌合到生殖腺并形成有功能的配子 , 该配子的基因型为 A, B , c, D 。当这样的配子与 C57 小鼠配子结合ch w a C,时 , 可形成 A , BB , DD 的个体 。该个体腹部白色 ,其它部分的毛色为野生色 。表 3 显示了嵌合鼠交配繁 殖的情况 。在所得到的 1473 只小仔中 ,没有出现毛色为野生色的小鼠 。所以 , 这些嵌合鼠无论嵌合率大小如何 , 都没能产生 ES 细胞的后代 。 雌 、雄两性嵌合鼠的繁殖情况 表 3 雄 性雌 性 ES 细胞的后 毛色嵌合率 毛色嵌合率 ES 细胞的后 嵌 合 鼠 小仔窝数 嵌 合 鼠 小仔窝数 ( )( )% % 代/ 小仔数 代/ 小仔数L A 2spot s 12 0/ 113 N 1spot 5 0/ 52 D T 20 13 0/ 110 1spot 4 0/ 34 ) 120 13 0/ 109 S 20 3 0/ 29 E B M 50 0 0 30 6 0/ 59 ) 3R 70 15 0/ 110 40 4 0/ 37 K F P 85 0 0 50 5 0/ 54 H 90 12 0/ 88 Q 95 7 0/ 67 O C 90 18 0/ 130 > 95 5 0/ 35 G U > 90 18 0/ 149 > 95 4 0/ 33 L > 95 21 0/ 159 )2 > 95 9 0/ 74 J 4 0/ 31 总数?100 总数 135 0/ 1073 43 0/ 400 ) ) ) 1出生 4 周后死亡 ; 2出生后第 13 周死亡 ; 3不育。 3 讨论 ( ) 1993 年 , Wood 等人报道了用 ES 细胞 R - 1 进行囊胚注射 ,注射后移胚 631 个 ,出生 250 只 40 %,嵌合体 95〔18〕()() () 只 15 %。本实验注射 136 个胚 ,移胚 119 个 ,出生 63 只 53 %,嵌合体 21 只 17 . 6 %。这一比率达到了国外 〔8〕报道的相应水平。ES 细胞嵌合体的制作除了技术的原因以外 , 还涉及许多其他方面的因素 。例如 , ES 细胞本 〔11〕身的分化能力 , 二倍体状态 , 传代的代数, 生长状况及所处时相等 。此外 , 提供 ES 细胞的动物品系与受体胚 〔15〕( 的动物品系之间的搭配也十分重要。在实验中 , 虽然在以上诸方面都做了相应的考虑 , 但每批实验的结果 表 ) 2在出生率和嵌合体的产生上仍有差异 ,说明还有一些尚未掌握的因素 , 有待进一步深入研究 。 〔12〕Robert so n 等人报道 , XX 核型的 ES 细胞与 X Y 核型的相比显得极不稳定。在体外培养的过程中 ,一根 X 染色体易发生部分的缺失或整根地丢失 。到目前为止 , 只有 3 个 XX 核型的 ES 细胞系嵌合进生殖腺 , 形成有功 〔13 , 14〕能的配子并产生后代 , 这 3 个 ES 细胞系都出自同一个实验室。相比之下 , X Y 核型的 ES 细胞用得较为广 () () 泛 , 主要是因为 1X Y 核型的 ES 细胞与 XX 核型相比 , 在体外培养的情况下比较稳定 。2通过性别偏离现象可 获得较多的雄性嵌合鼠 。如果这种偏离现象是由性转换引起的 , 而且获得的雄性动物又是可育的 , 则该动物所产 () 生的配子往往只来源于引进的 ES 细胞 。3获得较多的雄性嵌合鼠 , 有利于快速进行种系嵌合的分析 。雌性小 〔2〕鼠在其整个生殖生涯中约可产生 100 只小仔 , 而雄性小鼠只用 4 —5 周的时间就可以达到同样的数目。本实验 所用的 ES 细胞系也是 X Y 核型 , 其正常二倍体细胞占 70 %以上 。但嵌合鼠中并没有发生性的偏离现象 。 通过实验我们发现 ES 细胞 M ESPU 13 具有很高的嵌合能力 。尽管如此当将所得到的嵌合鼠与 C57 品系小鼠 〔7〕相配进行繁殖时 , 没有发现腹部为白色的野生色小鼠即 ES 细胞的后代 。Koller 等人曾经报道, 把 ES 细胞 ES98 - 12 显微注射到 ICR 品系小鼠的受体囊胚中产生了嵌合鼠 , 但未能获得 ES 细胞的后代 。随着实验的进行 , 他们 发现 ES 细胞的嵌合力急剧下降 , 同时在所用的 ES 细胞中检测到了支原体的污染 。本实验一共进行了 8 次的显 微注射实验 , ES 细胞的嵌合率一直比较稳定 , 并没有出现急剧下降的倾向 , 但嵌合鼠没能产生 ES 细胞后代 。 参 考 文 献 〔1 〕 偻木元也 , 1987 . 发生工学实验 ろ“ , 讲谈社 S ƒ J . <=? t J ? 〔2 〕 Bradley A , 1987 . 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