免疫组化
免疫组化实验
一、 实验目的:
1、学习了解免疫组织化学实验原理,
2、掌握免疫组化实验一般性步骤。
二、 实验器材:
已固定好的未脱蜡的组织切片、光学显微镜、二甲苯、梯度酒精、PBS缓冲液、双氧水、一抗工作液、二抗工作液、辣根过氧化物酶、DAB、盐酸乙醇、苏木精染液、自来水、蒸馏水、中性树胶、载玻片、盖玻片、染色缸、镊子等。 三、 实验步骤:
1、 已固定好的未脱蜡的组织切片脱蜡步骤如下表:
100% 100% 95% 80% 70% 50% XI X? 1:1 AI A? AI AI AI AI ,二甲苯, ,二甲苯,
7min 7min 7min 2min 2min 1min 1min 1min 1min
注:表格中第1行为脱蜡步骤中使用的试剂,第2行则为每步所对应的脱蜡时间,脱蜡从左到右依次进行。
2、脱蜡后蒸馏水槽中流水冲洗2次,5min/次。水速不能过快否则容易将组织切片冲掉。
3、PBS浸洗3次,5min/次。最后一次冲洗后用滤纸将残液吸净。
4、3%HO,无色液体,去离子水孵育15min。(以消除内源性过氧化物酶22
活性,防止过氧化物酶造成的非特异性背景染色,孵育时间不能过长,否则易造成脱片)
5、PBS浸洗3次,5min/次,最后一次冲洗后用滤纸将残液吸净。
O 6、滴加适当比例稀释的一抗, 4C湿盒孵育过夜,一般12-18h即可,。,滴加一抗时要设臵阴性对照一个。阴性对照可滴加PBS。,
7、取出湿盒室温静臵30min。
8、PBS浸洗3次,5min/次,最后一次冲洗后用滤纸将残液吸净。
9、滴加生物素标记的二抗工作液,室温孵育2h。
10、PBS浸洗3次,5min/次最后一次冲洗后用滤纸将残液吸净。
O 11、滴加辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素工作液,37C湿盒孵育30min。
12、PBS浸洗3次,5min/次,最后一次冲洗后用滤纸将残液吸净。
13、滴加稀释好的DAB显色液,室温显色7min。镜检控制显色程度。
14、蒸馏水洗以终止反应。
15、将切片放在酸性苏木精中复染3min,染核 淡蓝色最好,。
16、HCl-乙醇中分色40-50s镜检,核染色不深适中,目的物质着色明显最佳,
17、自来水蓝化,15min,,后入蒸馏水洗一次。
18、脱水步骤如下:
50%AI 1:1 70% 80% 95% 100% 100% XI X?
(酒精) AI AI AI AI A? ,二甲苯, ,二甲苯,
,,,,,,,,,1 1 1 1 2 2 7 7 7
注:表格中第1行为脱水步骤中使用的试剂,第2行则为每步所对应的脱水时间,脱水从左到右依次进行。
19、用中性树胶进行封片操作,并于显微镜下观察。
四、 实验结果及分析:
1、细胞核和细胞浆染色不太分明,可能原因是盐酸乙醇分色时间不足,致使苏木素染色后细胞核中结合的染料过量。
2、本组实验并没有进行抗原修复,但与没有进行复染的小组相比,特异性显色的细胞,棕黄色,并不是太多,所以排除抗原修复这方面的原因,但是否是由于复染引起有待进一步确定。
五、 实验中的注意事项:
1、HO孵育时间不能过长,否则容易造成脱片现象。由于本实验中采用22
的是防脱切片,所以在实验过程中没有过多注意这方面的问题。
2、为了长期保存,我们一般用中性树胶封片,切记要避免产生气泡,可用方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手用镊子夹住盖片某一拐角,而另一手用镊子拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接触到液体时为止,当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会产生气泡。
3、自来水蓝化过程中,保证水的流速不能太快,以免产生脱片现象。