猪卵母细胞体外成熟及乙醇孤雌激活研究

猪卵母细胞体外成熟及乙醇孤雌激活研究 猪卵母细胞体外成熟及乙醇孤雌激活研究 面北展盐2007,16(2):1,6 ActaAgriculturaeBoreal~一occidentalisSinica 猪卵母细胞体外成熟及乙醇孤雌激活研究 李晟阳,罗光彬,张晓华,何丽华.,赵立虎, 任康,肖焕星,刘永 (1_沈阳农业大学动物胚胎工程实验室,沈阳110161;2.中国农业大学动物科技学院,北京100094 3.中国科学院微生物研究所,北京100080) 摘要:探讨了不同基础培养液(mTCM-199,NCSU23)和PMSG,HCG浓度,作用时间对猪卵母细胞体外成 熟的影响和乙醇及乙醇与各种化学试剂联合处理对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活,孤雌生殖胚胎发育的影 响,最终找到了优异的猪卵母细胞体外成熟培养体系,并确定了乙醇孤雌激活的适宜浓度,作用时间和与不同 化学试剂联合处理的适宜组合.结果表明:优化的猪卵母细胞体外成熟培养体系为NCSU23+20IU/mI PMSG+20IU/mLHcG+10PFF,激素作用时间为45h,成熟率可达70.3土3.9;乙醇的适宜激活浓度 为8,激活率为29.6+2.5;乙醇激活的适宜处理时间为10min,激活率为32.6?4.1;乙醇与cB+ CHX联合处理的激活率最高,激活率为60.8土3.2,卵裂率,3,4细胞率,6,8细胞率分别为45.1? 3.0,28.6土3.7,8.7土1.2;乙醇与CB+6-DAMP联合处理的激活率为51.7?1.9,卵裂率,3 , 4细胞率,6,8细胞率分别为41.7?3.6,30.3%?4.3,9.9?1.8,虽然激活率,卵裂率低 于乙 醇与cB+CHX处理组,但3,4细胞率,6,8细胞率均高于乙醇与CB+CHX处理组 (30.3?4.3对 28.6土3.7,9.9土1.8对8.7?1.2).因此,乙醇激活的适宜方法为:8乙醇处理 10min,CB+ 6一DAMP处理7h. 关键词:猪;PMSG;HCG;基础培养液;孤雌激活;乙醇 中图分类号:$852.21文献标识码:A文章编号:1004—1389(2007)02—0001—06 StudyoninVitroMaturationofPorcineOocytesandEthanolActivation LISheng—yang,LUOGuang—bin,ZHANGXiao—hua,HELi—hua, ZHAOLi—hu,RENKang,XIAOHuan—xingandLIUYong (1_IaboratoryofAnimalEmbryoEngineering,HusbandryandVeterinaryCollege,ShenyangAgricultureUniversity,Shenyang 110161.China;2.CollegeofAnimalScience8LTechnology,ChinaAgricultureUniversity,Beijing100094,China; 3.InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100080,China) Abstract:Theobjectiveofthepresentstudywastoinvestigatetheeffectoftwodifferentbasicinvitro maturation(IVM)mediums(mTCM一 199,NCSU23),concentrationandtreatmenttimeofpregnant mareserumgonadotropin(PMSG)andhumanchorionicgonadotropin(HCG)onIVMofporcineOO— cytes;furthermore,toexaminetheeffectofethanolandethanolplusvariouschemicalagentsonpar— thenogeneticactivationandthedevelopmentofparthen0geneticembryos.TherationalIVMmatura— tionofporcineoocytessystemisNCSU23+20IU/mLPMSG+20IU/mLHCG? 10PFF,ofwhich thematurationratewas70.3? 3.9.Thebestparthenogeneticactivationconcentrationofethanol was8(activationrate:29.6?2.5).Thebestactivationlengthofexposureby8ethanolwas 10min(activationrate:32.6?4.1).ActivationbyethanolassociatedwithCB+CHXgotthe 收稿日期:2006—06—05修回日期:2006一?一l5 基金项目:辽宁省科技项目资助(2003212). 作者简介:李晟阳(1981一),男,辽宁沈阳人,在读研究生,研究方向:动物胚胎工程. *通讯作者:罗光彬(1959一)男,朝鲜族,博士,教授.主要研究方向为动物配子与胚胎 生物工程. 西北农业16卷 highestactivationrate(60.8?3.2),andtherateofcleavage,3,4cells,6,8cellswere45.1? 3.0,28.6?3.7,8.7?1.2,respectively.TreatedbyethanolassociatedwithCB+6, DMAP,theratesofactivation,cleavage,3,4cells,6,8cellswere51.7?1.9,41.7? 3.6,30.3 ?4.3,9.9? 1.8%,respectively;althoughtheratesofactivationandcleavagewerelowerthanthat ofethanolplusCB+CHX,theratesof3,4cells,6, 8cellswerehigher.Theseresultsindicatethat thebestmethodofactivationofpigoocytesbyethanolplusvariouschemicalagentswas8etha nol treatingfor10min,andthenoocytestreatedbyCB+6-DAMPforanother7h. Keywords:Porcine;Basicinvitromaturationmedium;Pregnantmareserumgonadotropin( PMSG); Humanchorionicgonadotropin(HCG);Parthenogeneticactivation;Ethanol 猪体细胞克隆技术在生物医药方面的重要应 用就是在异种器官移植上,因为猪的器官和人的 器官很相似,而且猪繁殖快,产仔多,可以作为异 种器官移植的供体_l;在农业方面,应用猪体细胞 克隆技术可改良猪的品种,提高猪的生产性能. 如可以对猪的基因进行修饰,使猪的瘦肉率增多, 抗病力增强?].尽管体细胞核移植技术已在牛, 羊,小鼠,猪等动物上获得成功,但总效率仍很低, 而猪的体细胞核移植效率更低,出生活仔数与移 植胚的比率仅为1左右_3"].很多因素影响核 移植胚的发育,其中一重要因素是受体卵母细胞 的体外培养成熟率和激活率_6低,极大的限制 了猪体细胞克隆在实际生产中的应用.本研究旨 在克服猪卵母细胞体外成熟,孤雌激活率低的难 题,为猪体细胞克隆技术更早的应用于畜牧生产, 器官移植奠定基础. 1材料与方法 1.1试剂 若未经特殊标注,均购于Sigma公司. 1.2猪卵巢及卵丘一卵母细胞复合体(COCs)的 收集 猪卵巢由沈阳市东生屠宰场采集,摘取刚屠 宰的母猪卵巢,立即放入添加双抗(国产)的30, 35.C灭菌生理盐水中,1h内送回实验室.卵巢 组织用灭菌的生理盐水清洗3次,除尽周围的脂 肪和系膜,用灭菌的医用纱布吸干,再用12号针 头的无菌注射器(内有少量平衡后的DPBS+5% FBS)抽取卵巢表面直径为2,6mm的卵泡.抽 取的卵泡液用洗卵液稀释后,静置片刻在立体显 微镜下捡卵,根据卵丘细胞的层数,致密度和卵母 细胞胞质的均匀程度将卵丘一卵母细胞复合体 (COCs)分为4级,其中A级:卵丘在3层或以 上,包裹致密,卵母细胞胞质黑色均一;B级:卵丘 为1,2层,包裹较为致密,胞质黑色均一;C级: 卵丘疏松扩散,胞质较为均一;D级:为裸卵,或细 胞质残缺.本实验仅取A,B类COCs用于成熟 培养. 1.3卵母细胞的体外成熟培养 捡出的COCs用DPBS+5%FBS洗涤3次, 然后用培养液洗涤3次,移入含成熟培养液滴的 35mm培养皿中,每个液滴50肚I,覆盖石蜡油, 每滴放15,20枚,液滴预先在39?,5的CO, 饱和湿度条件下平衡2h以上.基础培养液: mTCME,NCSU23~引. 1.4卵母细胞成熟的判定 体外培养45h的卵母细胞,与含0.1%透明 质酸酶的DPBS在培养箱内作用5min,随后震荡 4min除去卵丘细胞.在4×1O倍实体显微镜下 观察第一极体是否存在,以第一极体排出作为卵 母细胞成熟的,并取部分压片,在乙醇,冰醋 酸(3:1)固定液中固定48h,再用1醋酸地衣 红染色1,2min,用相差显微镜观察成熟卵母细 胞核. 1.5体外成熟卵母细胞的孤雌激活和孤雌生殖 胚胎的体外培养 挑选体外成熟卵母细胞,于各浓度乙醇的 DPBS溶液中作用数分钟,再分别于含10~g/mL CHX,7.5gg/mICB,2mmol/I6-DMAP,7.5 >g/mLCB+10>g/mLCHX,7.5>g/mLCB+ 2mmol/L6-DMAP的NCSU23中作用7h,激活 处理结束后,转到NCSU23+10FBS中培养. 1.6体外成熟卵母细胞的孤雌激活鉴定 乙醇单独处理或乙醇和各种化学试剂联合激 活后,于胚胎培养液中培养24h后,乙醇,冰醋酸 (3:1)固定液中固定48h,再用19/5醋酸地衣红 染色1,2min,用相差显微镜观察.卵母细胞发 生卵裂或形成1个原核或两个原核为激活. 2期李晟阳等:猪卵母细胞体外成熟及乙醇孤雌激活研究 1.7试验 1.7.1不同基础培养液及激素作用时间对猪卵 母细胞体外成熟的影响试验1:分别以mTCM- 199和NCSU23为猪卵母细胞体外成熟培养基础 培养液,分4为个实验组,要求每组试验至少重复 5次.试验组1和试验组2以mTCM一199为基础 培养液,试验组1在培养全程中均含有激素 (PMsG,HCG);试验组2在培养前22h含有激 素,后23h在培养液中除去激素,于mTCM一199 +1OPFF中继续培养23h.试验组3和实验 组4以NCSU23为基础培养液,试验组3在培养 全程中均含有激素;试验组4在培养前22h含有 激素,后23h在培养液中除去激素,于NCSU23 +1OPFF中继续培养23h. 试验组1:mTCM一199+10IU/mLPMSG+ 10IU/mIHCG+10PFF(45h);试验组2: mTCM一199+10IU/mIPMSG+1OIU/mI HCG+1OPFF(22h);试验组3:NCSU23+10 IU/mIPMSG+10IU/mLHCG+10PFF(45 h);试验组4:NCSU23+10IU/mLPMSG+10 IU/mLHCG+10PFF(22h). 1.7.2不同激素剂量对猪卵母细胞体外成熟的 影响试验2:以NCSU23为猪卵母细胞体外成 熟培养基础培养液,分为一个对照组和5个实验 组,分别添加0(对照组),10,15,20,25,30IU/ mL的PMSG和HCG,要求每组试验至少重复5 次.对照组不添加激素,试验组1,2,3,4,5分别 添加10,15,20,25,30IU/mI的PMSG和 HCG. 对照组:NCSU23+10PFF;试验组1:NC— SU23+1OIU/mLPMSG+1OIU/mLHCG+10 PFF;试验组2:NCSU23+15IU/mLPMSG+ 15IU/mLHCG+10PFF;试验组3:NCSU23+ 20IU/mLPMSG+2OIU/mIHCG+10PFF; 试验组4:NCSU23+25IU/mLPMSG+25IU/ mIHCG+10PFF;试验组5:NCSU23+3OIU/ mIPMSG+3OIU/mIHCG+10PFF. 1.7.3乙醇浓度对猪体外成熟卵母细胞激活率 的影响试验3:检验乙醇浓度对激活猪体外成 熟卵母细胞的影响.试验分为4组,要求每组试 验至少重复4次.对照组,试验组1,试验组2,试 验组3的乙醇浓度(v/v)分别为0,5,8, 10,处理8min,处理结束后换到NCSU23+ 1OFBS中培养24h后染色,观察原核. 1.7.4乙醇作用时间对猪体外成熟卵母细胞激 活率的影响试验4:检验乙醇作用时间对激活 猪体外成熟卵母细胞的影响.试验分为5组,要 求每组试验至少重复4次.乙醇浓度固定为8 (v/v),对照组,试验组1,试验组2,试验组3,试 验组4的乙醇处理时间分别为0,5,8,10,12 min.处理结束后换到NCSU23+10FBS中培 . 养24h后染色,观察原核 1.7.5乙醇与各种化学试剂联合处理对猪体外 成熟卵母细胞激活率的影响试验5:检验乙醇 与CB,CHX,DMAP,CB+CHX,CB+DMAP等 化学试剂联合作用对激活体外成熟卵母细胞的影 响.试验分为5组,要求每组试验至少重复4次. 8乙醇处理10min后,试验组1,试验组2,试验 组3,试验组4和试验组5分别于7.5/~g/mL CB,10/~g/mLCHX,2mmol/IDMAP,7.5g/ mICB+10/~g/mLCHX,7.5/~g/mLCB+2 mmoL/LDMAP处理7h,作用结束后换到NC— SU23+10FBS中培养24h后染色,观察原核. 1.7.6乙醇与各种化学试剂联合处理对猪孤雌 生殖胚胎的体外发育的影响试验6:检验乙醇 与CB,CHX,DMAP,CB+CHX,CB+DMAP等 化学试剂联合作用对孤雌生殖胚胎发育的影响. 试验分为5组,要求每组试验至少重复5次.8 乙醇作用10min后,试验组1,试验组2,试验组 3,试验组4和试验组5分别于7.5ptg/mLCB,10 ptg/mLCHX,2mmol/IDMAP,7.5ptg/mLCB +10ptg/mLCHX,7.5ptg/mLCB+2mmol/L DMAP处理7h,处理结束后换到NCSU23+ 1OFBS中培养,每48h更换一次培养液. 1.8数据分析 所得资料采用Spssl1.5统计软件进行显着 性检验.对成熟率进行单因素方差分析,多重比 较用邓肯式法.P<O.05时确定为差异显着. 2结果与分析 2.1不同基础培养液及激素作用时间对猪卵母 细胞体外成熟的影响 由表1可见,以NCsU23为基础培养液的试 验组3,试验组4的成熟率(61.1?1.5, 59.6?3.2)均显着高于以mTCM一199为基 础培养液的试验组1,试验组2的成熟率(49.5 ?2.3,50.6?3.2).说明两种基础培养液 在添加相同物质的情况下,NCsU23比mTCM- 西北农业16卷 199更适合用于猪卵母细胞体外成熟培养.试验 组3,试验组4均以NCSU23为基础培养液,但试 验组4的培养后23h去除激素环境.相关研究报 道认为_g],在体外成熟培养的后20,24h去处激 素环境,有利于猪卵母细胞的核成熟.但本实验 无论以NCSU23(试验组3:61.19/6?1.59/6;试验 组4:59.69/6?3.2)或ITITCM一199(试验组1: 49.5?2.39/6;试验组2:50.6?3.29/6)为基 础培养液都没有得到相同结果,在培养过程中去 除激素环境对成熟率影响不显着.所以以下试验 中,以NCSU23为基础培养液,激素作用时间45 h. 表1不同基础培养液及激素作用时间对猪卵母细胞体外成熟的影响 Table1EffectofdifferentbasicmediumsandthelengthofhormonetreatmentonIVMofporci neoocytes 注;实验重复5次,表中同列数剧右上标的字母不同者表示差异达0.05量着水平.表2,6同此. Note:Experimentswererepeatedfivetimes.a,b,Cvalueswithdifferencesuperscriptweresig nificantlydifferentwithincolumn(P< 0.05).Table2and6aresameas. 2.2不同激素剂量对猪卵母细胞体外成熟的影 响 试验组1,试验组2,试验组3,试验组4,试验 组5的成熟率(6Q.9?2.4,62.9?2.49,6, 70.3?3.9,66.1?2.6,58.6?2.0) 均显着高于对照组的成熟率(38.9?1.8). 提高猪卵母细胞成熟率有明显的促进作用.试验 组3成熟率最高(70.3土3.9),且显着高于试 验组2,试验组4,试验组5.说明在体外成熟培养 过程中,PMSG,HCG的最适添加剂量为20IU/ mL(表2).根据试验1,2的结果,猪卵母细胞体 外成熟培养的最佳体系为:NCSU23+20IU/mL 说明在体外成熟培养过程中添加PMSG,HCG对PMSG+20IU/mLHCG+10~froPFF. 表2不同激素剂量对猪卵母细胞体外成熟的影响 Table2EffectofdifferenthormoneconcentrationsonIVMofporcineoocytes 表3乙醇浓度对猪体外成熟卵母细胞激活的影响 Table3Effectofethanolconcentrationsonactivation ofporcineoocytesmaturedinvitro 注;实验重复4次.同列数剧右上标的不同字母表示差异达0.05 着水平.表4,5同此. Note:Experimentswererepeatedfourtimes:a,b,Cvalueswith differencesuperscriptweresignificantlydifferentwithincolumn (P<0.05).Thesameastable4,5. 2.3乙醇浓度对猪体外成熟卵母细胞激活的影 晌 分别用0(对照组),59/6,8,10的乙醇作用 8rain,3个处理组的激活率(23.19/6?2.3%, 29.6?2.5,16.9?2.3)均显着高于对照 组(4.4%?1.79/6).8%组的激活率最高,且显着 高于10组,但与5oA组差异不显着.根据试验3 的结果,在试验4中采用89/6的乙醇用于激活处理 (表3). 2.4乙醇处理时间对猪体外成熟卵母细胞激活 的影响 以8的乙醇分别作用0(对照组),5,8,10, 12rain,4个处理组的激活率(21.8?1.89/6, 26.5?1.2%,32.6?4.1%,29.6?3.2%) 均显着高于对照组(6.39/6?2.5%).10rain组的 激活率最高(32.69/6?4.1),且显着高于5rain 2期李晟阳等:猪卵母细胞体外成熟及乙醇孤雌激活研究 组,但与8min,12min组差异不显着(表4).根 据试验3,试验4的结果,乙醇激活猪体外成熟卵 母细胞的最佳方法是浓度为8,作用时间为1O min. 表4处理时间对猪体外成熟卵母细胞激活的影响 Table4Effectofactivationofporcineoocytematuredin vitroaccordingtolengthofexposureby8%ethanol 表5乙醇与CB,CHX,DMAP,CB+CHX,CB+DMAP 联合处理对猪体外成熟日母细胞激活的影响 Table5Effectonactivationofporcineoocytesmaturedin vitrotreatedbyethanolorethanolplusvariousagents 注:Note:CHX..10t~g/mL,CB:7.5t~g/mL,6-DMAP:2mmol/L. 2.5乙醇与CB,HX,DMAP,CB+CHX,CB+DMAP 联合处理对猪体外成熟卵母细胞激活的影响 由表5可见,先用8乙醇作用10min,再分 别用7.5/~g/mICB,10/~g/mLCHX,2mmol/I DMAP,7.5~g/mLCB+10~g/mLCHX或7.5 /~g/mLCB+2mmol/LDMAP处理7h,激活率 分别为48.5?3.0,44.4?1.9,40.5? 1.4,6O.8?3.2,51.7?1.9,其中ET +CB+CHX组激活率最高,显着高于其他各组. 2.6乙醇与各种化学试剂联合处理对孤雌生殖 胚胎发育的影响 由表6可见,先用8乙醇作用10min,再分 别用7.5/~g/mLCB,10/~g/mLCHX,2mmol/L DMAP,7.5/~g/mLCB+10/~g/mLLHX或7.5 /~g/mLCB+2mmol/LDMAP处理7h,卵裂率分 别为4O.1?5.0,37.5?2.3,33.3? 2.2,45.1?3.0,41.7?3.6%,3,4细胞 率分别为15.0?3.2,2O.2?2.6,15.0% ?2.2,28.6?3.7,3O.3?4.3,6,8细 胞率分别为1.5?0.9,6.3?1.6,4.9 ?1.4,8.7?1.2,9.9?l_8.ET+CB +CHX,ET+CB+CHX两组的卵裂率,3,4细 胞率,6,8细胞率均高于其他各组,但两组之间差 异不显着.虽然ET+CB+6一DMAP处理组激活 率,卵裂率低于ET+CB十CHX处理组,但3,4 细胞率,6,8细胞率均高于ET+CB+CHX处理 组(30.3?4.3和28.6?3.7,9.9? 1.8和8.7?1.29/6).因此,乙醇激活的最佳 方法为:8乙醇处理10min,CB+6一DAMP处理 7h. 表6乙醇与各种化学试剂联合处理对孤雌生殖胚胎发育的影响 Table6Effectondevelopmentofporcineoocytesmaturedinvitrotreatedbyethanolplusvario uschemicalagent 注:Note:CHX;10~g/mL,CB:7.5~g/mI,6-DMAP:2mmol/I. 1,寸论 卵母细胞IVM的基础培养基有两种,一种是 含有能量物质的简单盐溶液培养基,如NCSU一 23;另一种是复合型组织培养基,如TCM199.尽 管采用其他基础培养基如TLP—PVA[], mKRBE.WaymouthMB752/1c.WhittenS mediuml_】.也能培养成功,但以TCM一199和NC— SU一23成熟率效果最好.本研究分别以TCM一199 和NCSU一23为基础培养液,添加了相同的物质, NCSU一23的成熟率高于TCM一199,且显着差异, 说明NCSU一23更适合应用于猪卵母细胞体外成 熟培养.为模拟卵母细胞体内发育环境,绝大多 数研究者都在卵母细胞IVM过程中添加促性腺 激素,类固醇激素或两者的混合物.秦鹏春等口 认为follicularstimulatinghormone(FSH),lute— inizinghormone(LH)在猪卵母细胞体内成熟和 排卵时起重要作用,但似乎PMSG,HCG对促进 ? 6?西北农业16卷 体外成熟更为有效.本研究证实了秦鹏春等的观 点,添加PMSG,HCG的各处理组的成熟率均显 着高于对照组,其中添加20IU/mLPMSG和 HCG的处理组成熟率最高(70.39/6?3.9%). 乙醇对卵母细胞的激活主要是通过水解细胞 膜上4,5--"磷酸磷酯酰肌醇产生1,4,5一三磷酸肌 醇,从而诱发细胞内源钙释放到细胞质,提高了胞 内的钙离子浓度口.本研究结果表明,乙醇激活 猪体外成熟卵母细胞的合适浓度为8,处理时间 10min.CHX和6-DMAP作为蛋白合成抑制剂 和蛋白磷酸化抑制剂,对卵母细胞具有激活功能. CHX通过阻止cyclinB的合成,导致卵母细胞内 MPF活性下降而激活卵母细胞_】引.而6-DMAP 则是通过影响MAPK和MPF的活性来激活卵母 细胞[17].在孤雌激活时,二倍体胚胎比单倍体胚 胎发育能力强.因此,常用CB处理激活卵来提高 孤雌发育胚胎中二倍体胚胎的比例_】.本研究用 乙醇与CB十CHX联合激活处理获得了最高激活 率,但乙醇与CB+6一DMAP联合激活卵子的发 育情况好于其他组合. 本研究表明:猪卵母细胞体外成熟最佳的培 养体系为NCSU23+20IU/mLPMSG+2OIU/ mLHCG+10PFF;猪体外成熟卵母细胞采用 乙醇激活的最佳激活方案是用8乙醇处理1O rain,再用7.5/~g/rnLCB+2rnmol/LDMAP处 理7h. 参考文献: [1]LaiLX,SimondDK,KwangwP,eta1.Productionofe-1,3一 Galactosyltransferaseknockoutpigsbynucleartransferclo— ning[J].Science,2002,295:1089~1092. [2]NiemannH,RathD,WrenzyckiC.Advancesinbiotech一 [3] [4] nology:newtoolsinfuturepigproductionforagriculture andbiomedicine[J].ReprodDomestAnita,2003,38(2):82 , 89. BetthauserJ,ForsbergE,AugensteinM,eta1.Production ofclonedpigsfrominvitrosystems[J].NatBiotechnol, 2000,18(10):1055,1059. OnishiA.1wamotoM,AkitaT,eta1.Pigcloningbymicro— injectionoffetalfibroblastnuclei[J].Science,2000,289 (5482):II88,II90. 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