肿瘤相关糖抗原sTn的提纯及其单克隆抗体的制备

肿瘤相关糖抗原sTn的提纯及其单克隆抗体的制备 肿瘤相关糖抗原sTn的提纯及其单克隆抗 体的制备 226LabeledImmunoassays&ClinMed,Dec.2007,Vo1.14,No.4 肿瘤相关糖抗原sTn的 提纯及其单克隆抗体的制备 章万忠,陈智周,范振符 (1.华北石油井下医院检验科,河北任丘062552; 2.中国医学科学院肿瘤医院核医学科,北京100021) 摘要:提纯肿瘤相关糖抗原sTn并研制针对它的单克隆抗体(mAb).取羊颌下腺经溴棕三甲铵沉淀,经Sepha— roseCL一4B等获取羊颌下腺粘蛋白(OSM),将OSM采用脾内注射,完全佐剂2种方法免疫Balb/C小鼠.常规 方法细胞融合,用ELISA间接法筛选阳性细胞并测定效价,双抗体竞争抑制试验识别sTn位,采用免疫组化 检测sTn在胃癌组织中的表达.最终获得2株可分泌sTnmAb细胞株(2F6,7E4),均为小鼠IgG1亚类,2株 mAb抗相同抗原表位.免疫组化染色显示胃癌组织中sTn表达阳性率较高,可达71.4,且与胃癌进程相关. 本文成功提纯了sTn抗原并制备了2株杂交瘤细胞株,在胃癌的诊断和治疗中有潜在的应用价值. 关键词:羊颌下腺粘蛋白;唾液酸化Tn;单克隆抗体;免疫组织化学 中图分类号:R392—33文献标识码:A文章编号:1006—1703(2007)04—0226—04 PurificationofTumor-associatedantigensTn andPreparationofMonoclonalAntibodiesagainstsTn ZHANGWan—zhong,CHENZhi—zhou,FANZhen—fu (DepartmentofClinicalLab.,HuaBeiOilFieldJingXiaHospital,Renqiu062552.China) Abstract:Topurifytumor-associatedantigensTnandpreparemonoclona1antibodyagainsti t,O— vinesubmaxillarymucin(OSM)afterprecipitationbyC19H42NBrwaspurifiedandconcentrated byaSepharoseCL一 4Bcolumn.OSMwasusedastheantigentoimmunizeBalb/Cmiceintwo differentways,directspleeninjectionandtheroutineimmunization.Aftercellfusion,indirect ELISAwasusedtoscreenpositivecellsanddeterminethetitreoftheantibodies.Doubleanti— bodycompetitiveinhibitionexperimentwasusedtoidentifythesTnepitope.Immuno— histo— chemica1analysiswasemployedto1ocatesTnSexpressioningastriccarcinomatissues.There— suitsshowedthattwostrainsofmonoclona1antibodies(2F6and7E4)wereobtained.Bothof thembelongtotheIgG1subclassandtargettosTnepitopeinOSM.Immuno— histochemicalan— alysesshowedthatsTnwerewidelyexpressedingastriccarcinomatissues,withapositiverate of71.4.ThehighpositiveratesofsTnarecloselyrelatedtothestagesofthedisease.The resultssuggestedthattwostrainsofmonoclonalantibodiesagainstsTnweresuccessfullypre— pared;theycouldpossiblybeusedinthediagnosisandtreatmentofgastriccancer. Keywords:()vinesubmaxillarymucin;SialosylTn;Monoclonalantibody;Immuno—histo — chemica1analysis 利用淋巴细胞杂交瘤技术生产单克隆抗体 (mAb)是现代免疫学的一7欠重大突破.研制肿瘤 特异性好的mAb将有助于建立更为有效的血清学 免疫和病理免疫组化检测方法,研制肿瘤疫苗口], 收稿日期:2007—03一l3;修回日期:2007—04一l6 并可利用mAb作为肿瘤导向治疗载体,在临床应 用方面具有广阔前景.本文利用富含Sialosyl—Tn (sTn)的羊颌下腺粘蛋白(OsM)作为免疫原,制备 sTnmAb,研究该抗体所识别表位的组织分布和肿 瘤特异性,进而建立一种血清学的免疫检测方法, 为癌症,尤其是胃癌的临床诊断和治疗提供一种有 标记免疫分析与临床2007年1z月第14卷第4期 效的工具. 材料与方法 1材料 Balb/C小鼠(雌性,6,8周龄)以及昆明鼠购 自医科院肿瘤医院动物室.小鼠骨髓瘤细胞系 SP2/0由肿瘤医院核医学科提供.羟基磷灰石胶 (HTP—Ge1),DEAE—Affi-Gel-Blue购自美国Bio- Rad公司.SepharoseCL一4B购自瑞典Pharmacia 公司.抑酶肽购自Sigma公司.RPMI一1640培养 液和PEG(Mr4000)分别购自Gibco,Merck公 司.HT,HAT,羊抗鼠IgG—HRP,神经氨酸酶,抗 小鼠IgG亚类试剂盒购自Sigma公司.抗sTn标 准mAb(CA72—4)购自美国Centocor公司.21例 胃癌组织切片由医科院肿瘤医院病理科提供,所有 标本均经100mL/L福尔马林固定,脱水,常规石 蜡包埋,5肚m贴APES胶(Sigma)切片后,进行免 疫组织化学染色. 2方法 2.1羊颌下腺粘蛋白的提取取刚杀死的 山羊头,取出颌下腺,切成小片,清洗后放在组织打 碎机中加0.01mol/LNaC1溶液匀浆,加入2OO肚L 乙醚(需加入Aprotinin),匀浆液在12,000g,0, 4?离心20min.将沉淀在0.01mol/LNaC1溶液 中匀浆60s,离心.收集的上清液用2mol/I乙酸 调pH达4.7,再12,000g离心20min,弃去沉淀. 将1/10(w/V)的溴棕三甲铵溶液加入冷的上清 液中,不断搅拌,至沉淀完全后,用玻璃棒缠绕法收 集沉淀,用冷蒸馏水洗3次,再溶于50(w/V)的 CaC1:溶液中.羟基磷灰石胶按Levinl2的方法处 理后,加入溶液中,每毫克蛋白加入50mg干胶搅 拌,在10,000g离心.产品低温冻干,溶于 0.1mol/LNaC1中,利用逐滴加入的乙醇将其分步 沉淀,收集乙醇浓度应在6O,7O时沉淀.沉 淀溶于少量蒸馏水,对蒸馏水透析后冻干.Sepha— roseCL一4B凝胶过滤(2.5×80cm),PBS-NP-40 洗脱,分管收集.用CA72—4试剂盒确定sTn所在 的峰,收集浓缩.采用SDs_PAGE,制连续梯度胶 3,12,浓缩胶浓度为3,含0.1SDS- PAGE测定粘蛋白的分子量(考马斯蓝染色). 2.2抗sTn抗体的制备 2.2.1免疫以OSM为免疫原采用2种方 法免疫Balb/C小鼠.完全佐剂法按常规方法:基 础量和追加量为腹腔注射,每只50gg(0.5mL)1 227 次,间隔2周,免疫5针.脾内免疫法:第1针先将 小鼠麻醉,暴露脾脏,用4号针头沿脾脏从一端刺 入直至另一端,边拔针,边注射抗原(2O肚g/ 0.2mL),注射完毕后缝皮,第2针至第5针同上免 疫法.细胞融合及克隆化筛选参考文献E3]方法, 采用辛酸一硫酸铵纯化腹水. 2.2.2mAb特性的鉴定效价测定:杂交瘤 细胞培养上清及其诱生的腹水中mAb的效价测定 采用间接ELISA法.Ig亚类鉴定:采用ELISA检 测试剂盒(Sigma公司).表位分析:采用硫酸铵沉 淀法及DEAE—Affi—Gel—Blue层析法.纯化的腹水 mAb标记HRP,做间接ELlSA,检测抗sTn标准 抗体(cA72—4)及所制备的mAb对酶标记抗体的 封闭情况.抗原决定簇特性分析:以looU/~L的抗 原浓度包被96孔板,其中一部分孔的抗原用 o.1U/mI的神经氨酸酶处理lmin,随后按常规 ELlSA方法进行.肿瘤组织中sTn表达的检测: 采用免疫组织化学染色法.石蜡切片常规脱蜡至 水,PBS振洗,加30mL/LH2O2作用20min,阻断 内源性过氧化物酶.继用100mL/L羊血清封闭 30min后,加入mAb(培养上清),以sTn标准抗体 (CA72—4)作为阳性对照,PBS作为阴性对照,4? 孵育过夜,PBS振洗,加入HRP标记的羊抗鼠 IgG(室温40min),同上振洗后,以DAB显色,苏木 精衬染,脱水,透明,封片,光镜观察.肿瘤细胞染 色大于5者判为阳性. 结果 1羊颌下腺粘蛋白的提取 共用腺体34.79g(湿重),获得的OSM的量约 为60mg,产率约为0.2.OSM上柱后收集到三 个蛋白峰,通过CA72—4试剂盒获得二个sTn活性 峰,浓缩后测定活性为7×1OU/mI,蛋白浓度为 0.57mg/mL.3,12SDS—PAGE结果表明, OSM蛋白分子量过大(大于300kD),无法进入胶 中,这导致无法采用Western-blots进行单抗鉴定. 该结果与文献1-4]报道一致,OSM分子量约为 420kD(Tiselieus电泳). 2抗sTnmAb杂交瘤细胞株的建立 两种免疫方法比较,免疫第5针后小鼠眼球取 血检测抗体效价分别为:脾内免疫法血清效价为 1:10,1:10;完全佐剂免疫法为1:10.结果 表明(见表1)脾内注射免疫效果较好,融合后克隆 形成率明显高于完全佐剂法.经反复筛选,3次克 228LabeledImmunoassays&ClinMed,Dec.2007,Vo1.14,No.4 隆化后,获得与OSM反应呈阳性,与神经氨酸酶为2F6,7E4. 处理的OSM呈阴性的杂交瘤细胞2株,分别命名 表1细胞融合,筛选和克隆化 注:?为皮下注射免疫;方案?为脾内注射免疫 3mAb特性的鉴定 ?效价测定:2株mAb(2F6,7E4)的腹水效 价分别为1:25600和1:12800;细胞培养上清的 效价分别为1:128和1:64. ?IgG类别鉴定:2株mAb均为IgG1. ?表位分析:以HRP标记的mAb2F6 (HRP一2F6)做封闭实验表明,mAb2F6和7E4对 HRP一2F6与OSM结合的阻断作用与sTn标准抗 体相同,表明它们与sTn标准抗体均作用于同一 表位. ?抗原决定簇特性分析:OSM经神经氨酸酶 处理后与2F6,7E4的mAb反应明显降低,表明这 两株mAb所识别的抗原决定簇属多糖类,而且其 结构同唾液酸有关,结果见图1. : . 0? 醯 :: 稀释倍数 图1mAb2F6与神经氨酸酶处理后的抗原反应 4肿瘤组织的免疫组化染色 以mAb2F6作为一抗对2l例胃癌组织切片 进行了免疫组化染色,其中有l5例为阳性,存在 sTn的表达,阳性率为71.4%,具体情况见表2. sTn在非癌细胞中的表达集中于邻近癌组织的化 生部分,在正常组织中无表达(见图2).sTn在早 期胃癌中的表达率较低(58.3%),在中晚期中表达 率则较高(88.9%),其表达主要集中于细胞膜表面 以及粘蛋白中,尤其是在细胞外腺管中. 表2sTn表达与临床病理因素的关系 组织学分型 分期 高分化 中分化 低分化 早期 中晚期 62(33.3) 8l(12.5) 73(42.9) 125(41.7) 9l(11.1) 4(66.7) 7(87.5) 4(57.1) 7(58.3%) 8(88.9) 讨论 目前有研究发现],细胞癌变常伴有细胞膜 表面糖脂或糖蛋白糖基化的改变,能观察到糖基合 成不完全并伴随前体的积累.这一现象在粘蛋白 ()I连接糖基化过程中可以更清楚的看到,不完全合 成会造成其核心结构T(Gal~l一3GalNaca—Ser/ Thr)或Tn(GalNAcal—Ser/Thr)的暴露.T/Tn 结构借助Ser/Thr连接于多肽链上,这些核心结构 一 般是唾液酸化的,例如人血型糖蛋白A的核心 结构是NeuAca2—3Gal~l一3(NeuAca2—6) GalNAcal—Ser/Thr.然而在正常组织中0一连接 的核心结构一般包含的是T结构,而不是Tn结 构.唾液酸化的Tn结构在人的正常组织中的分 布相当局限,而在肿瘤细胞中,由于合成不完全或 鱼疫分析与临床2007年l2月第14卷第4期 图2mAb2F6在胃癌组织中的免疫组织化学染色 1.高分化早期胃癌组织(×100); 2.中分化中晚期胃癌组织(×200);3.正常胃组织(×100) 是a2—6唾液酸化的早熟造成唾液酸化的Tn结 构(sTn)广泛分布l6].催化该唾液酸化的酶是 CMP-Neu5Ac:GalNAca2,6唾液酸转移酶 (ST6GalNAcI),在癌细胞系中导人ST6GalNAcI 的cDNA可直接诱导sTn结构的产生并提高癌细 胞的致癌性l_7].最近的研究表明,sTn的表达可降 低肿瘤细胞问的粘附性,加强肿瘤细胞迁移的能 力,从而有利于肿瘤的转移_8]. 229 由于在0SM中Sialosyl—Tn(sTn)结构占主导 地位,我们制备出针对OSMsTn表位的2株mAb (2F6和7E4).利用固相ELISA及神经氨酸酶的 分析表明它们的特异性良好.免疫组化研究表明, sTn在早期胃癌中的表达率较低,而在中晚期胃癌 中sTn表达率为88.8,可见sTn的表达与肿瘤 的进程密切相关,越到晚期sTn表达率越高.另 外,sTn表达只在化生及肿瘤组织中发现,在正常 粘膜中见不到sTn的表达.sTn的表达位置主要 处于细胞膜上.另外在腔面及细胞外腔管内容物 中也有表达,在高分化胃癌中尤其如此,这一点与 其它粘蛋白类型的碳水化合物抗原染色类型相似. 总之,sTn的高水平表达与胃癌较差的预后密切相 关,而这些抗体在肿瘤显像及靶向药物治疗方面将 会有重大意义,在胃癌的诊断和治疗中都将发挥一 定作用. 参考文献: [I]FrancoA.CTIbasedcancerpreventive/therapeutjcvaccines forcarcinomas:roleoftumourassociatedcarb0hydrateanti— gens1-J].SeandJImmunol,2005,61(5):391397. 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