【doc】用鸡胚卵黄囊分离斑点热群立克次体的研究

【doc】用鸡胚卵黄囊分离斑点热群立克次体的研究 用鸡胚卵黄囊分离斑点热群立克次体的研 究 / %) 47 用鸡胚卵黄囊分离斑点热群立克次体的研究? 毕德增生堡范明远,————一——一 R 擒要本文在甩传统的实验动物感染法分离立克次体同时,并尝试用鸡胚卵黄囊培 养法直 接分离立克次体.结果:用前者未分离出立克次体,而甩后者分别从来自北京昌平 县的中华革蜱 和来自黑龙江省虎林县的嗜群血蜱中各分离到1株立克次体.经鉴定,这两株立克 次体属于斑点 热群立克次体.结论:鸡肛卵黄囊培养法可以直接从现场节肢动物标本中分离病原 体. HensEggs. BiDe-~gZhangJian—zhiFanMing-yuan (DepartmentofRickettsiology.I~tituteofMicrobiologyandEpidemiology ChineseAcademyofPreventiveMedicineBeijing,102206) AtEmbryoz~tedhenseggsed加e幻isola~spottedfevezgroup(SFG)rickettsiae directlyfromthefieldsampleswhileexperimentalanimalwa8using.TwostrainsofSFGfieke t~iaewe isolateddirecdyfrownthefieldsamplesbyu血 embryonatedhen5eggll,norickettsiawasisohtedbyus— ingexperimentalanima1.TheresLdtsugg~tedthatembryonatedhenseggseouldbeusedtois olateSFG rickettsiaedirectlyfr'thefieldsamples Key_ndsSFGrickettsiaeIsolarion 斑点热群立克次体(SpottedFeverGroup Rickettsiae,SFGR)是专性细胞内寄生菌,分 离和纯化极为困难.所以,我国从1958年在 内蒙古阿巴嘎旗首次发现该群立克次体的感 染线索以来"J,经过30多年的研究,仅在北 方有限的几个省区分离到1O余株斑点热群 立克次体.鉴于我国是SFGR分布较广的国 家,进一步建立适合我国国情的分离斑点热 群立克次体的方法非常必要.为此,1993年 我们在用传统的实验动物感染法的同时,尝 - k国家自然科学基金,卫生部科研基金资助课题 作者单位:北京102206中国预防医学科学院疵行病 学微生物学研究所 试用鸡胚卵黄囊培养法直接分离立克次体. 现将结果如下: 1材料和方法 1.1标本的收集 蜱(嗜群血蜱,全钩硬蜱,森林革蜱)系我 们1993年4,5月间从黑龙江省虎林县(虎 头镇,小术河乡,独木河乡,珍宝岛,八五八农 场),饶河县(永乐乡),绥芬河市(市郊生产房 子)等地苔草地,阔叶林带及农田混合地缘处 采集,共计732只;中华革蜱系我们1993年5 月间从北京昌平县农村的刺猬身上收集,共 计3只. 1.2鸡胚的制奋 取受精的新鲜鸡蛋,置于37?恒温箱孵 育,每日通风两次,每次3O分钟.第6日取 出,弃去中止卵,余下活胚卵用于立克次体分 离. 1.3实验动特 大耳白兔和豚鼠. 1.4立克次体分离 活蜱先喂兔血,待吸饱血后分别作血淋 巴检验口J,并抽取被蜱叮咬的兔血进行血清 学检验,初步确定蜱感染的立克次体的种类. 取血淋巴检验阳性和可疑阳性的蜱,用无菌 盐水洗涤3次,放入75%酒精中1O分钟,再 用无菌盐水洗涤3次,然后中华革蜱3只为1 组,其余的蜱种每1O只为1组研磨,用SPG 缓冲液(0.28M蔗糖,0.0038M磷酸二氢钾, 00072M磷酸氨二钾,0.0049ML-谷氨酸单 晶钠盐)制成l:10悬液,加青霉紊和链霉紊 各1000--2000单位/rra,作用3O分钟.取 悬液分别接肿豚鼠和6日龄鸡胚,每组分别 接种2只豚鼠,每只2,4ml腹腔接种,其中1 只于发热高峰期取血液接传第2代,另1只 于4周后检查血清抗体.每组分别接种5个 鸡胚,每个鸡胚接种0.5ml悬液,感染鸡胚置 34.5?孵育,待4,5天鸡胚死亡后继续孵育 48,72小时,收获卵黄囊膜,涂片,Gimenez 染色],油镜观察. 2结果 2.1饱血蜱血淋巴试验结果 取各蜱种的饱血蜱做血淋巴试验,结果 见附表. 附寰蜱类斑点热群立克次体血淋巴试验结果 注:+代袁血淋巴试验阳性!代表可疑阳性 2.2被蜱叮咬的兔血清补体结合实验结果 取被蜱叮咬的兔血清,用已知的西伯利亚 立克次体(R.s/~'r/oa246株),康氏立克次体 (R.conor/iMalish7株),小蛛立克次体(R. akar/Kaplan株),普氏立克次体(R.prowazekl Breinl株),莫氏立克次体(R.mo0ser/Wilming. toll株),恙虫病立克次体(R.t.vutsuqamushl Raw株),Q热立克次体(Cozieltaburtu~iGrita 株)补结抗原进行微量补体结台实验.结果可 见,被来自北京昌平县中华革蜱和黑龙江省虎 林县,绥芬河市嗜群血蜱叮咬的兔血清,与 R.s/b/dm和R.conon'i补结抗原发生反应,血 清效价为l:32. 2.3脬鼠感染试验 将各蜱种的饱血蜱制成1:10稀释的悬 液,分别接种豚鼠,每种接种2只.结果可 见,被来自北京昌平县中华革蜱和黑龙江省 虎林县,绥芬河市嗜群血蜱以及绥芬河市嗜 群血蜱蜱卵感染的8只豚鼠,均于接种后第6 天发热,热度达4O?,热期持续4,5天.每 种取1只于发热高峰期解剖,观察病变,可见 4只豚鼠的脾脏分别肿大3倍或2倍,肝脏肿 大2倍或1.5倍.取上述豚鼠的脾脏和肝脏 制成1O%悬液,再分别接种豚鼠和6日龄鸡 胚卵黄囊,结果均未分离出立克次体. 2.4感染后脬鼠血清补体结合试验 取上述感染后第4周的豚鼠分别检查血 清抗体,结果4只感染豚鼠血清中均有与R. sibirlca和R.conorii补结抗原结合的抗体. 2.5鸡胚培养结果 取各蜱种饱血蜱制成1:10稀释的悬液, 分别接种6日龄鸡胚卵黄囊,每只鸡胚接种 0.5ml,每种接种5个鸡胚.待鸡胚死亡后解 剖,取卵黄囊膜涂片,Gimenez染色,油镜检 查.结果可见,中华革蜱悬液感染的鸡胚卵 黄囊有大量的立克次体(图1),而被虎林县 嗜群血蜱悬液感染的鸡胚卵黄囊膜仅有少量 的立克次体.将被虎林县嗜群血蜱悬液感染 的鸡胚卵黄囊连续在鸡胚卵黄囊膜中传l0 代后,方有大量的立克次体繁殖(图2). 圈1中华革蜱悬液感染的鸡肛卵黄囊膜涂片示 细胞内,外立克次体分布(BJ一93株)(Gimenez染 色.×l000) 圈2嗜群血蜱悬液感染的鸡胚卵黄囊膜涂片示 细胞外立克次体分布(HL-93株)(Gimenez染色. ×l000) 3讨论 立克次体是天然寄生在一些节肢动物体 内,并以这些节肢动物为媒介进行传播疾病 的一种胞内寄生菌.由于其专性细胞内寄生 特性,所以长期以来人们一直用实验动物感 染法进行病原体分离.这种分离方法虽然可 以从现场标本中分离出病原体,但因实验动 物来源困难,动物实验程序繁杂,实验动物的 影响因素多,故国内仅有个别有条件的实验 室实施,很难普及.近年来,国外有人-用 离心细胞培养法分离立克次体,虽然也从现 场标本中分离出病原体,但因需要专门的设 备和一定专业技能,也非一般实验室所能做 到.鸡胚培养法所需条件简单且经济,故我 们尝试用鸡胚卵黄囊培养法直接从现场标本 中分离病原体获得成功. 结果表明,同一批标本同时用实验动物 感染法和鸡胚培养法分离立克次体,结果前 法仅出现了立克次体感染的症象,即:肝脾肿 大,斑点热群立克次体抗体阳性,并未分离出 立克次体;而用鸡胚培养法分别从来自北京 昌平县的中华革蜱和黑龙江省虎林县的嗜群 血蜱中各分离到1株立克次体,经鉴定均属 于斑点热群立克次体.实验表明:鸡胚卵黄 囊培养法可直接从现场标本中分离病原体. 鸡胚卵黄囊培养法用于从现场标本中分 离立克次体最关键的环节是消除污染.因 此,我们使用了大剂量的抗生素,效果顿佳. 参考文献 1范明近等某地区斑疹伤寒,北亚蜱性斑疹伤寒,Q热及 立克扶体痘时血清学调查.中华卫生杂志.1964,9(1】: 46 2BurgdorferW.Herac[ymph0Atechniqueford眦ectL【? ofrickettsiaeinticksAmJTropMedHyg.1970.19: 1010 3GimenezDF.Stainingtickettsiaeinvdk.鼬cculttu~.sSn Teehn0l,1964.39:135 4Peter,0.RaoultDandGilotBIso]stionbvsa~itlve trlfugationee1]eultu~system52strainsofspottedfever groupticbttslaefromtickscollectedinf?,JC]in.Mi. erob[o1.1990,281597. 5Kelly.PJ,Dl~oultandPR.Ms$onfsoLstion0spotted fevergrouptickettsiaefrt~ntafiturstedticksusingamodffim— tin0fthe.嘶试fuBad0I卜s11d1vialtechniqueTrmas.R Soe.TropMedHyg1991,85:39'I. [收稿日期:1996—05—08]